[发明专利]一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫磁珠分离细胞的方法，具体涉及一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法。 

背景技术

含有精液的混合斑是强奸案件中最常见的生物物证，其成分包括男性细胞（如精子、阴茎脱落细胞、精浆中的白细胞等）和女性细胞（如阴道上皮细胞、血液中的各种细胞等）；如何分离并获得混合斑中男性成分即嫌疑人的精子并进行DNA分型是案件侦破和诉讼的关键；目前，解决混合斑DNA分型有三种途径：一是分离混合斑中来自不同个体的细胞；二是设计Y染色体特异的DNA基因座引物，用PCR特异扩增男性成分片段；三是将混合斑痕中所有的遗传标记都检测出来，然后与案件相关的所有个体进行比对分析；以上方法中第一种途径可以获得高识别率的嫌疑人DNA，其余方法获得的结果常难以认定嫌疑人，多为检验的补救措施； 

第一种途径中，国内外学者建立了以下方法；一是（Gill等）利用精子外包膜和核膜富含鱼精蛋白及硫醇蛋白交联网状结构，较体细胞具有更强的耐受力的结构特点，对混合斑中的细胞进行二步消化，即第一步消化体细胞，第二步消化精子；实践证明，二步消化法存在第一步体细胞消化不完全或精子被过度消化的问题，进而导致DNA检验后仍出现混合分型、女性分型或无结果；同时，二步消化法需要两次消化，耗时长，需反复离心，自动化程度低；尽管很多学者对二步消化法进行了改良，但仍无法解决上述难题；二是（Chen等）利 用精子与体细胞大小不同的特点，可利用带微小网孔的尼龙滤膜，把体积较小而呈卵圆形的精子与大而扁平的上皮细胞分离，但该方法也需要经较强烈的第一步消化，常造成精子被过度消化得不到男性分型的结局；三是（Elliot等）根据精子与体细胞形态结构差异，将光学显微技术与激光细胞切割技术相结合，利用激光捕获显微切割技术在显微镜下选取并切割精子细胞，得到单一男性DNA分型，但该方法需联合应用激光捕获显微切割仪器及低体系扩增仪器，实验条件要求苛刻，难于对批量检材检验，且不利于基层实验室的普及。 

发明内容

针对以上问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种流程少、操作简单、便于普及、分离效果好的免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，包括以下步骤： 

1）生物素标记抗精子膜蛋白抗体： 

向浓度为5mg/mL的MOSPD3抗体或浓度为5mg/mL的Anti-SPAG8抗体中加入浓度为1mg/mL的Sulfo-NHS-LC-Biotin，抗体与Sulfo-NHS-LC-Biotin的体积比为10:3～5，在离心管中混匀后3～5℃反应48～72小时；将离心管中的液体加入透析袋，加1L0.01mol/L，pH7.2的PBS3～5℃透析12～24小时；得到MOSPD3-生物素偶联物或Anti-SPAG8生物素偶联物； 

2）精子与抗体的结合： 

向精子与上皮细胞混合悬液中加入上述生物素标记的MOSPD3抗体或Anti-SPAG8抗体，置于Thermomixer comfort上孵育；离心，弃去上清液后加入预冷的洗涤液，震荡后离心，弃去上清，得到抗体-精子复合体； 

3）磁珠与抗体-精子复合体的结合： 

向步骤2）得到的抗体-精子复合体中加入吸附液，震荡混匀后加入磁珠， 室温孵育30～45分钟； 

4）精子与上皮细胞的分离： 

将步骤3）中的离心管置于磁分离架上吸附5～10分钟，吸弃液体；加入洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，重复两次； 

5）精子与磁珠的分离： 

向步骤4）中的离心管内加入300～500μL洗脱液，震荡，56～65℃放置5～10分钟后再次置于磁分离架上吸附3～5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。 

本发明应用免疫荧光技术检测筛选精子表面特异膜抗体，利用生物素标记上述抗体，通过亲和素（包被在磁珠上）偶联生物素，成功构建了磁珠-亲和素-生物素-抗体-膜抗原（精子）复合体，并优化相关试剂体系及建立相应操作流程，提高混合斑检验的能效；针对免疫分选技术应用于法医物证学领域存在的技术难点与关键点，简化了反复洗涤离心的繁琐过程，节省了二步消化的时间，特异抗体的应用，可特异性选择靶细胞，避免了差异裂解法混合分型问题。