[发明专利]一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法

权利要求书

1.一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，包括以下步骤：

1）生物素标记抗精子膜蛋白抗体：

向浓度为5mg/mL的MOSPD3抗体或浓度为5mg/mL的Anti-SPAG8抗体中加入浓度为1mg/mL的Sulfo-NHS-LC-Biotin，抗体与Sulfo-NHS-LC-Biotin的体积比为10:3～5，在离心管中混匀后3～5℃反应48～72小时；将离心管中的液体加入透析袋，加1L0.01mol/L，pH7.2的PBS3～5℃透析12～24小时；得到MOSPD3-生物素偶联物或Anti-SPAG8生物素偶联物；

2）精子与抗体的结合：

向精子与上皮细胞混合悬液中加入上述生物素标记的MOSPD3抗体或Anti-SPAG8抗体，置于Thermomixer comfort上孵育；离心，弃去上清液后加入预冷的洗涤液，震荡后离心，弃去上清，得到抗体-精子复合体；

3）磁珠与抗体-精子复合体的结合：

向步骤2）得到的抗体-精子复合体中加入吸附液，震荡混匀后加入过量磁珠，室温孵育30～45分钟；

4）精子与上皮细胞的分离：

将步骤3）中的离心管置于磁分离架上吸附5～10分钟，吸弃液体；加入洗涤液洗涤、磁分离架吸附、吸弃液体，重复两次；

5）精子与磁珠的分离：

向步骤4）中的离心管内加入300～500μL洗脱液，震荡，56～65℃放置5～10分钟后再次置于磁分离架上吸附3～5分钟，回收洗脱液于另一离心管，洗脱液内得到分离的精子。

2.根据权利要求1所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于：步骤2中所述向精子与上皮细胞混合悬液中加入生物素标记的抗体，按照10³～10⁵个精子加0.1～0.5μg抗体的比例加入抗体；所述孵育的条件为37℃800～1200rpm孵育1～2小时或4℃孵育12～24小时。

3.根据权利要求1所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于：步骤3中所述加入的磁珠量按照抗体-精子复合体与磁珠的个数比为1:8～20加入。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于：所述洗涤液为0.01mol/L PBS,0.5%BSA,2mM EDTA,pH7.2。

5.根据权利要求1或2或3所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于：所述吸附液为0.01mol/L PBS，0.5%BSA，pH7.2。

6.根据权利要求1或2或3所述的一种免疫磁珠分离精子与上皮细胞混合斑中精子的方法，其特征在于：所述的磁珠直径为2.8μm。