[发明专利]以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法

说明书

技术领域

本发明属于X射线成像方法技术领域，尤其涉及一种单次测量具有对称性微纳米样品的二维衍射数据来实现样品结构三维重建的X射线成像方法。

背景技术

随着同步辐射光源亮度的不断提高，X射线成像方法得到了快速的发展，新的X射线成像方法不断涌现，成像分辨率也在进一步提高。由于X射线具有波长短，穿透能力强的特点，是进行高分辨三维成像的理想光源。目前Micro-CT和Nano-CT成像技术已经日趋成熟，分别可以获取大样品的微米分辨率三维结构和较小样品的纳米分辨率的三维结构。但是由于X射线难以聚焦，目前的X射线CT的最高成像分辨率不超过30nm。利用第三代和第四代同步辐射光源高相干性和高亮度的特点，相干X射线衍射成像方法得到了广泛的重视和快速的发展。由于相干X射线衍射成像方法不以透镜为成像元件，摆脱了透镜质量对成像分辨率的限制，理论上可以达到原子分辨率。将相干X射线衍射成像方法与断层扫描成像方法相结合，目前可以获得10nm分辨率的三维成像结果。

但是无论以上何种成像方法，在实现样品三维成像的过程中均需要测量大量的投影，不仅增加了数据采集时间，而且也会由于长时间曝光而对样品产生严重的辐射损伤。尤其对于生物样品来说，辐射损伤问题是限制生物样品分辨率进一步提高的主要因素。目前冷冻透射电子显微镜单颗粒成像技术已经被广泛应用于单颗粒病毒等全同性样品的三维高分辨成像。其利用样品具有全同性的特点，通过大量测量样品在实空间中的图像，结合图像处理方法对样品透射电镜图像进行筛选和降噪处理，利用等价线和投影匹配的方法确定样品的取向和中心以及实现各图像之间的归一化，对已处理电镜照片进行二维傅里叶变换，从而实现大量病毒样品衍射图样的三维重组，最后利用三维傅里叶逆变换实现病毒样品的三维成像。该方法已经成功实现了多种病毒三维结构的解析，并且在全同蛋白颗粒三维结构解析中得到了广泛的应用。但是冷冻电子显微镜在实现单颗粒三维成像过程中同样需要拍摄大量的全同颗粒的实空间图像，同时考虑到电子对生物样品具有严重的辐射损伤，需要减少电子剂量，因此所获得的透射电镜照片衬度较低，图像质量较差，需要对数据进行筛选和降噪音处理，使得数据处理变得繁琐。

相比于电子，X射线对样品的辐射损伤更小，但是对于病毒等生物单颗粒样品来说，由于其对X射线的衍射能力较弱，很难获取高质量的衍射信号，得到较高分辨率的重建图像。为了进一步提高成像分辨率，需要增加相干X射线衍射成像技术的曝光时间，不仅对成像设备的稳定性有较高的要求，而且也容易因为长时间X射线辐照使样品结构发生变化。目前相干X射线光源亮度的提高为解决该问题提供了光源基础。X射线自由电子激光作为第四代同步辐射光源具有全相干、亮度高、短脉冲的特点，其脉冲时间可以达到飞秒，能够在样品破坏之前记录下其衍射数据，成功的解决了样品辐射损伤的问题，能够对自然状态下的样品进行成像，是实现原位、动态成像的理想光源。X射线自由电子激光技术与相干X射线衍射成像技术相结合是目前研究的重点，其为实现单次测量对称性微纳米样品实现三维重建的成像方法提供了可能，并在解析对称性晶体结构和病毒结构以及非结晶性的全同颗粒结构，如多种细胞膜复合物，分子伴侣，核糖体等样品三维结构中具有重要的应用价值。然而，经检索以X射线自由电子激光为光源，单次照射对称性微纳米样品实现样品三维重建的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法。

本发明所述以X射线单次测量实现对称性微纳米样品三维成像的方法，步骤包括：样品制备，对称性样品二维衍射数据的获取，单颗粒正入射二维衍射数据选取，单颗粒正入射衍射数据的处理，样品的空间取向确定，样品的三维衍射数据获取，对三维衍射数据进行相位恢复和三维重建。具体是：

1）制备浓度适中的单分散性样品：将具有对称外形的纳米晶体或病毒样品进行纯化处理，得到粒径和形貌相同的全同样品。

将纯化之后的样品进行稀释，利用超声或震荡方式分散处理1～10分钟，充分分散样品，用移液器取样品1-10μL滴至厚度为20～200nm的Si₃N₄薄膜上，并使膜表面上的样品密度不高于0.1个/μm²，即制得单分散样品。

上述具有对称外形的纳米晶体优选是四六面体纳米晶，偏方三八面体纳米晶，三八面体纳米晶或六八面体纳米晶；上述具有对称外形的病毒优选二十面体病毒颗粒。