[发明专利]青虾EST-SSR分子标记的引物组、标记方法及应用

说明书

 

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及淡水经济甲壳动物青虾（日本沼虾，Macrobrachium nipponense）EST（expressed sequence tags, ESTs）微卫星标记（EST-SSR）的筛选和应用。

 

背景技术

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense) ，隶属十足目（Decapoda），长臂虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium），广泛分布于中国、日本、韩国、越南、缅甸等亚洲国家，具有营养价值高、生长快、适应能力强等特点，深受广大消费者的欢迎，是重要的经济养殖虾类。我国目前有18个省市（区）进行青虾养殖，其养殖面积居淡水虾类第一位。《中国渔业年鉴》2011年统计数据显示，青虾在我国养殖年产量约23.02万吨，养殖年产值超过100亿元。但目前养殖的青虾大多数为未经系统遗传选育的野生种在池塘多代养殖的后代，随着青虾养殖业的高速增长，集约化程度的不断提高，近年来出现了严重的品种退化现象，严重制约了青虾养殖业的发展。要实现青虾养殖的可持续发展，必须对青虾进行遗传改良。目前，国内渔业遗传改良方法主要以群体选育为主。采用该种方法得到的后代个体亲缘关系不明，因此需要更精确的分子水平方法辅助进行有效鉴别，从而能建立选育群体的谱系，有效减少近交，即分子标记辅助育种方法。

EST是短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一部分。近年来，大量数据库中EST数量迅速增长，其中大量EST中含有微卫星序列（microsatellite，又叫simple sequence repeats，SSR），为EST-SSR标记的开发提供了丰富的序列资源。由于EST-SSR标记开发是基于基因组中的表达序列，与普通基因组微卫星标记（genomic-SSR，gSSR）相比具有信息量大、通用性好、开发简单快捷、费用低等优点，更重要的是，该标记能直接和功能基因相关，在分子标记辅助育种的相关研究如遗传连锁图构建、重要性状相关标记关联分析、分离和鉴定新基因等中都有极高的应用价值。

目前青虾EST数据库中包含大量EST序列，已有报道从这些序列中克隆得到多个性别、生殖、发育等相关基因，而从青虾EST文库中筛选多态微卫星标记的方法至今没有报道。

 

发明内容

本发明利用生物学信息学方法从青虾促雄腺转录组文库（http://www.ffrc.cn/gene/list.asp）中搜索EST微卫星序列，并筛选具有多态的微卫星引物，找到青虾EST-SSR标记的特异引物，为青虾的青虾群体遗传多样性分析提供可用的分子标记。进一步可以利用该EST-SSR标记技术研究青虾选育群体的遗传特征和群体结构，实现分子标记在青虾育种中的初步应用，为构建高密度青虾遗传连锁图片、QTL定位重要经济性状进行分子标记辅助育种奠定基础。具体的技术方案是：

一种青虾EST-SSR分子标记的引物组，其特征在于，包括有如下3个位点所对应的正向和反向引物：

EWXM33

F: AACATTCACTGGCTCTTCG(SEQ ID NO.1)

R: CCACTACTGTTTCTATCCACC(SEQ ID NO.2)

EWXM62

F:GCTTGTAGAAACCCGTAG(SEQ ID NO.3)

R:CTCTGACCTGCTTAGAAAA(SEQ ID NO.4)

EWXM147

F:ATTGTCGTAGGCTCACGT(SEQ ID NO.5)

R:AAAATTGGTCTTGCTCCC(SEQ ID NO.6)

本发明还提供了一种基于上述EST-SSR分子标记的引物组的青虾分子标记方法，包括如下步骤：

第1步、提取青虾样本的DNA；

第2步、使用分子标记引物组对青虾样本进行PCR扩增；

第3步、对扩增产物进行电泳分析，利用电泳结果对青虾进行分类。

上述的PCR扩增中，反应体系可以包括有：2.5mM dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP） 1μL，10×Buffer 2.5μL，25mM MgC1₂ 2μL，8pmol/μL的两侧引物各0.75μL，5 U Taq DNA 聚合酶0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL，用超纯水补足至25μL。