[发明专利]一种检测桃蚜抗药性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对农业害虫抗药性进行监测的测定技术方法，具体地说，是以诊断剂量检测桃蚜对有机磷和氨基甲酸酯类两大系列杀虫药剂抗药性的方法。

背景技术

桃蚜是世界上分布最广最为重要的害虫之一，可以在50多个科400多种植物上取食，不仅能够直接刺吸植物营养，造成植物严重失水和营养不良，还可以传播病毒，对植物造成更大的间接伤害，对农业生产造成巨大的经济损失。长期以来，对桃蚜的防治主要以化学防治为主，由于化学杀虫剂的大量、持续及不合理使用，致使许多国家和地区的桃蚜对常用杀虫剂产生了不同程度的抗药性。

乙酰胆碱酯酶作为神经系统胆碱激性传导的重要组分，主要功能是快速水解神经传递介质—乙酰胆碱。以乙酰胆碱酯酶为分子靶标发展了有机磷和氨基甲酸酯类两大系列的杀虫药剂。昆虫乙酰胆碱酯酶基因在这两类药剂的胁迫作用下，发生变异后会导致抗药性的产生。

桃蚜抗药性的形成和发展给化学防治造成了很大困难，如何快速、准确的检测桃蚜抗药性水平是非常重要的。现在用于抗药性监测的方法主要包括传统的生物测定、生化检测法、免疫学方法以及分子生物学方法，其中生化检测方法是简单快速准确反映靶标酶变异情况的检测方法。

现有技术利用生化方法测定桃蚜抗药性，一般采用分光光度计，测定群体比活力，这种方法不但用虫量大，而且操作程序复杂。本发明采用酶标仪法，利用诊断剂量可快速诊断桃蚜个体抗性水平，用虫量少，通过个体抗性水平了解种群抗性水平，简化操作，仪器自动化读数精确，可以同时了解个体及种群抗性水平，诊断剂量的应用，可以快速准确区别抗性水平高低的个体，从而了解种群抗性水平，指导田间用药。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测桃蚜抗药性的方法，其是在诊断剂量下采用酶标仪动力学法检测桃蚜田间种群个体对有机磷或氨基甲酸酯类杀虫药剂的抗药性。

所述有机磷杀虫药剂为氧化乐果，氨基甲酸酯类杀虫药剂为抗蚜威；所述诊断剂量氧化乐果为180.43μM，抗蚜威为18.85μM。

进一步地，氧化乐果和抗蚜威的诊断剂量的获得是通过选用室内选育的敏感种群；采用酶标仪动力学法，分别测定氧化乐果和抗蚜威对敏感种群AChE的抑制曲线；根据测定的抑制曲线，计算氧化乐果和抗蚜威抑制该敏感种群90%AChE活性的浓度，即IC₉₀，作为氧化乐果和抗蚜威AChE的诊断剂量。

所述室内敏感种群为田间采集桃蚜种群，室内单头饲养反选多代后获得。

更为具体地，上述确定氧化乐果和抗蚜威的诊断剂量的具体步骤包括：

（1）桃蚜室内敏感种群的饲养：桃蚜田间种群室内单头饲养反选多代，获得敏感种群。

（2）丙酮稀释抑制剂为不同的浓度梯度：所述抑制剂为氧化乐果和抗蚜威。

（3）缓冲液的配制：pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液。

（4）底物ATChI的配制：母液浓度2.5mM，底物终浓度为0.5mM，保存于4℃冰箱中，备用。

（5）显色剂DTNB的配制：母液浓度37.5μM，显色剂终浓度为15μM，保存于4℃冰箱中，备用。

（6）酶液的制备：挑选120头无翅成蚜，加入2mL磷酸缓冲液，使用匀浆器冰浴匀浆，酶液10800g，4℃离心15min，之后将离心上清液稀释定容至24mL。

（7）96孔酶标板中加入50μL步骤（6）制备的酶液。

（8）将步骤（2）稀释好的各浓度抑制剂50μL、步骤（4）配置的底物ATChI50μL以及步骤（5）中的显色剂DTNB100μL混合均匀后加入到步骤（7）对应有酶液的孔中，轻轻混匀。

（9）将步骤（8）的酶标板405nm动力学测定15min，测定氧化乐果和抗蚜威对敏感种群AChE的抑制曲线。

（10）根据测定的抑制曲线，计算氧化乐果和抗蚜威对该敏感种群的IC₉₀，作为氧化乐果和抗蚜威AChE的诊断剂量。

其中，步骤（2）中的抑制剂的稀释用含0.05%Triton的磷酸缓冲液，稀释至7～8个浓度梯度。

其中，步骤（4）和步骤（5）中底物和显色剂的配置均用步骤（3）制备的磷酸缓冲液配制。

其中，步骤（6）用于匀浆的匀浆器及缓冲液需提前冰浴5min。

其中，步骤（6）中制备酶液的缓冲液为步骤（3）制备的含0.05%Triton的pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液。

其中，步骤（8）中最终反应体系中丙酮含量不超过0.5%。

本发明的有益效果在于：