[发明专利]一种检测桃蚜抗药性的方法

权利要求书

1.一种检测桃蚜抗药性的方法，在诊断剂量下采用酶标仪动力学法检测桃蚜田间种群个体对有机磷或氨基甲酸酯类杀虫药剂的抗药性，其特征在于，所述有机磷杀虫药剂为氧化乐果，氨基甲酸酯类杀虫药剂为抗蚜威；所述诊断剂量氧化乐果为180.43μM，抗蚜威为18.85μM。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氧化乐果和抗蚜威的诊断剂量的获得是通过选用室内选育的敏感种群；采用酶标仪动力学法，分别测定氧化乐果和抗蚜威对敏感种群乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制曲线；根据测定的抑制曲线，计算氧化乐果和抗蚜威抑制该敏感种群90%AChE活性的浓度，作为氧化乐果和抗蚜威AChE的诊断剂量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述室内敏感种群为田间采集桃蚜种群，室内单头饲养反选多代后获得。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，氧化乐果和抗蚜威的诊断剂量是通过如下步骤确定的：

（1）桃蚜室内敏感种群的饲养：桃蚜田间种群室内单头饲养反选多代，获得敏感种群。

（2）用丙酮配置抑制剂母液，用0.05%Triton X-100磷酸盐缓冲液稀释抑制剂母液到不同的浓度梯度：所述抑制剂为氧化乐果和抗蚜威。

（3）缓冲液的配制：pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液。

（4）底物ATChI的配制：母液浓度2.5mM，底物终浓度为0.5mM，保存于4℃冰箱中，备用。

（5）显色剂DTNB的配制：母液浓度37.5μM，显色剂终浓度为15μM，保存于4℃冰箱中，备用。

（6）酶液的制备：挑选120头无翅成蚜，加入2mL磷酸缓冲液，使用匀浆器冰浴匀浆，酶液10800g，4℃离心15min，之后将离心上清液稀释定容至24mL。

（7）96孔酶标板中加入50μL步骤（6）制备的酶液。

（8）将步骤（2）稀释好的各浓度抑制剂50μL、步骤（4）配置的底物ATChI50μL以及步骤（5）中的显色剂DTNB100μL混合均匀后加入到步骤（7）对应有酶液的孔中，轻轻混匀。

（9）将步骤（8）的酶标板405nm动力学测定15min，测定氧化乐果和抗蚜威对敏感种群AChE的抑制曲线。

（10）根据测定的抑制曲线，计算氧化乐果和抗蚜威对该敏感种群的IC₉₀，作为氧化乐果和抗蚜威AChE的诊断剂量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的抑制剂的稀释用含Triton的磷酸缓冲液，稀释至7～8个浓度梯度。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）配制的缓冲液为含0.05%Triton的pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）和步骤（5）中底物和显色剂的配置均用步骤（3）制备的不含Triton的磷酸缓冲液配制。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（6）用于匀浆的匀浆器及缓冲液需提前冰浴5min。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（6）中制备酶液的缓冲液为步骤（3）制备的含0.05%Triton的pH7.5，0.1M的磷酸缓冲液。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（8）中最终反应体系中丙酮含量不超过0.5%。