[发明专利]一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法

说明书

技术领域

本发明主要是通过金黄色葡萄球菌适配体对金黄色葡萄球菌的特异性识别，并且通过酪胺信号放大的方法来实现可视化检测的。本发明涉及到分子生物学和微生物学的方法及技术，属于生物技术领域。

背景技术

近些年来，食品质量与安全越来越引起人们的关注，并逐渐成为了一个社会焦点和热点问题，这其中由食源性致病菌引起的食品安全问题还是比较多的。金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌，它会产生一些对人体有毒的物质，比如毒素、酶和一些菌体成分。根据美国疾病预防与控制中心的统计，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，占到整个细菌性食物中毒病例的33％，位居第二位，而加拿大则高达45％。因此研究一种能够对金黄色葡萄球菌实现快速、准确、经济、可靠的检测方法是非常有必要的。但是一些传统的检测方法由于在特异性、灵敏度和操作方面存在着各种缺陷，无法满足人们对于食品安全的要求。

适配体是一种具有能够与靶分子高亲和性和特异性结合的一段DNA或RNA序列，这些靶分子包括一些药物、蛋白和其他有机、无机小分子，它是利用体外筛选技术一指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)，从含有10¹³-10¹⁵不同随机序列的DNA或RNA核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。此外由于适配体具有稳定、容易合成和进行化学修饰等优点，因此，适配体被广泛的应用于分析检测、疾病的诊断和治疗等方面，并且适配体在生物、化学及医学等领域有着十分重要的应用前景。

酪胺信号放大(TSA)技术是一种基于辣根过氧化物酶(HRP)催化的生物信号放大技术，其原理是在HRP酶催化下，大量连接半抗原的酪胺分子的沉积，这些半抗原主要是生物素、荧光光素等小分子物质。目前TSA技术在分子原位杂交、ELISA、分析检测、疾病诊断等方面有着十分广泛的应用。

发明内容

鉴于现有检测技术在检测的灵敏度、检测时间以及特异性上存在的缺陷，本发明主要是针对这些缺陷，提供了一种快速、特异性强、灵敏度高的可视化检测金黄色葡萄球菌的新方法。

本发明的优点：

(1)由于金黄色葡萄球菌适配体能够高亲和力和特异性的与靶物质结合，因此本方法具有较高的特异性。

(2)本发明中所涉及的各种试剂廉价易得，节省了实验成本，并且实验的操作步骤比较简单，因此，本发明在成本及实验操作具有优势。

(3)本发明对金黄色葡萄球菌的检测限比较低，达到了8cfu／mL；而且检测范围较大，在10⁷-10cfu／mL范围内线性良好(R²=0.9976)。

附图说明

图1是特异性实验；a.金黄色葡萄球菌，b.鼠伤寒沙门氏菌，c.副溶血性弧菌，d.化脓链球菌，e.阪崎杆菌，f.大肠杆菌，g.单增李斯特菌。

图2是标准曲线；

图3是酪胺放大技术在本实验中的作用；a.未应用酪胺信号放大技术的检测方法，b.本方法

图4是本方法与传统平板计数法的相关性实验。

实验步骤：

1、合成生物素修饰的金黄色葡萄球菌适配体(上海生工生物工程股份有限公司完成)。

生物素修饰的适配体：5'-biotin-C6-GCA ATG GTA CGG TAC TTC CTC GGC ACG TTC TCA GTA GCG CTC GCT GGT CAT CCC ACA GCT ACG TCA AAA GTG CAC GCT ACT TTG CTAA-3’。

2、制备生物素-酪胺。

准确称取10mg Bio-NHS,溶于1mL DMF中制成溶液A；称取2.8mg的酪胺盐酸，溶于0.28mL DMF中，然后加入2.8μL的三乙胺，制成溶液B；将溶液A与溶液B充分震荡混匀，然后在室温下避光反应2h，加入8.72mL无水乙醇，从而制得10mL生物素-酪胺溶液，并于4℃环境避光保存。

3、亲和素包被酶标板

将亲和素(1mg/mL)用碳酸盐包被液(Na₂CO₃0.16g，NaHCO₃0.29g，100mL H₂O：pH9.6)按1：100稀释，每孔包被200μL，置于4℃环境，12h，拍干，用1×PBST(1×PBS缓冲液+0.05％(v／v)吐温20)洗涤3次，每次1分钟，拍干。