[发明专利]一种检测赭曲霉毒素A的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农产品、饲料和食品中的真菌毒素快速、高通量、低成本检测技术方法。具体通过谷物中典型的赭曲霉毒素A为检测对象，利用三维光子晶体微球为载体，通过核酸适配体识别技术和荧光分析技术相结合构建液相芯片检测新技术。

背景技术

赭曲霉毒素(Ochratoxin)是曲霉属和青霉属等产毒菌株产生的一种有毒的次级代谢产物。自然界中产生赭曲霉毒素的真菌种类繁多，主要以纯绿青霉(Penieilliumverrucosum)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、和碳黑曲霉(Carbonarius)为主。赭曲霉毒素主要包括A、B、C、D等7种结构类似物，其中毒性最强、最为常见、分布最广的是赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)。OTA对食品污染的范围较广，包括谷物及谷物产品、豆类、咖啡豆、葡萄干、葡萄汁和啤酒等。赭曲霉毒素具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，不但会引起人畜的急、慢性中毒，还具有致癌、致畸、致突变的潜在危害。OTA被认为是危害性仅次于黄曲霉毒素的真菌毒素。1993年,国际癌症研究机构(The International Agency for Research on Cancer,IARC)将其定为IIB类致癌物。鉴于OTA的毒性，会给人类和动物的健康带来巨大威胁，因此世界上许多国家和组织都很重视对OTA的控制，制定了食品、饲料中赭曲霉毒素的相关法规和限量标准，并积极研究相关检测方法。目前常用的检测方法有薄层色谱法（TLC）、气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳技术（CE）、酶联免疫吸附法(ELISA)等。这些常用的检测方法对赭曲霉毒素A的检测起着非常重要的作用，但是这些方法或多或少存在一些缺陷如：样品前处理复杂、仪器昂贵、灵敏度低等，而且随着科学技术的发展以及检测水平的提高，对食品中的赭曲霉毒素A限量标准的要求也在不断地提高，传统的检测方法已不能满足现在的检测需求。因此建立一种快速、高通量、高灵敏度、成本低、特异性好的检测方法，从而对农产品中存在的真菌毒素进行有效监控十分必要。

发明内容

本发明目的在于开发一种高灵敏度、高通量、低成本、检测时间快、特异性好的检测食品中赭曲霉毒素A新技术，以替代传统色谱技术或酶联免疫法（ELISA）赭曲霉毒素A检测的方法。

本发明的原理如图1所示，用浓硫酸(98%)与浓过氧化氢溶液(30%)按照体积比7:3混合的洗液清洗光子晶体微球，同时进行羟基化修饰，用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）对微球表面修饰环氧基，固定赭曲霉毒素A-核酸适配体，牛血清蛋白（BSA）封闭，加入荧光标记互补序列进行杂交，加入样品中赭曲霉毒素A后，使其与核酸适配体的特异性结合，同时互补杂交的荧光标记序列从微球上解离，从而引起荧光信号的变化，利用芯片扫描仪对荧光信号进行检测。

本发明所述用单珠光子晶体微球检测赭曲霉毒素A的方法，是利用固定在光子晶体微球上的核酸适配体序列与其荧光标记互补序列进行杂交，通过加入待测样品，利用芯片扫描仪对加入样品前后的荧光信号进行检测；根据测得的荧光信号的变化值对样品中的赭曲霉毒素A进行检测；所述核酸适配体序列是：5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-NH₂-3′；荧光标记互补序列是5′-FITC-TGT CCG ATG CTC CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-3′。

只要样品中存在赭曲霉毒素A，就会与核酸适配体的特异性结合，同时互补杂交的荧光标记序列从微球上解离，从而引起荧光信号的变化，因此只要检测到加入样品前后的荧光信号发生了变化，就表明样品中含有赭曲霉毒素A。

进一步地，我们可预先建立荧光信号的变化值与赭曲霉毒素A标准溶液浓度的关系作为定量分析指标，就可根据测得的荧光信号的变化值对样品中的赭曲霉毒素A进行定量检测。

上述方法包括以下步骤：

（1）光子晶体微球的制备

（2）光子晶体微球表面功能化：通过体积比3：7的双氧水与浓硫酸对步骤（1）得到的微球表面进行羟基化修饰，再用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）对微球表面进行环氧基修饰；