[发明专利]一种以油脂为原料生产甲羟戊酸的方法及其构建的基因工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种经过遗传修饰的真养产碱杆菌，以及利用真养产碱杆菌发酵生产甲羟戊酸的方法。

背景技术

甲羟戊酸代谢途径广泛存在于多种生物中，甲羟戊酸是甲羟戊酸代谢途径中一个重要的中间代谢物，可作为前体进一步合成多种具有重要生理功能的类异戊二烯化合物如异戊二烯、类胡萝卜素，辅酶Q10，青蒿素，紫杉醇等。

作为类异戊二烯化合物的前体化合物，甲羟戊酸具备越来越重要的商业价值，目前可以通过微生物发酵法来生产甲羟戊酸。如可以在工程菌中表达甲羟戊酸代谢途径的重组酶来实现甲羟戊酸的发酵（Tabata et al.,2004Biotechnology Letters,26:1487-1491；Piteta et al.,2007Metabolic Engineering,9:193-207），尽管上述研究利用不同的工程菌和不同的重组酶进行甲羟戊酸及其下游衍生物的发酵,但是均有一个共同点,就是以糖为原料进行发酵。从理论上来讲1.5分子的糖生成3分子的乙酰辅酶a，再生成1分子的甲羟戊酸,该过程中每生产1分子甲羟戊酸就损失3个碳原子，因此理论质量转化率只有52%。而在实际生物发酵的过程中糖至甲羟戊酸的转化率要低于这个理论值，因此以糖为原料进行甲羟戊酸发酵的转化率较低，限制了其商业化应用。

发明内容

本发明提供了一种经过遗传修饰的真养产碱杆菌，降低真养产碱杆菌将油脂类底物合成PHA的能力，提高油脂类底物经乙酰辅酶A至甲羟戊酸的碳代谢流比率。

所述降低真养产碱杆菌将油脂类底物合成PHA的能力是通过敲除phaC1基因实现的。

具体而言，所述经过遗传修饰的真养产碱杆菌，是在敲除phaC1基因的真养产碱杆菌中导入外源羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因。

优选地，粪肠球菌（Enterococcus faecalis）羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的全长序列信息已经公开。（Tabata et al.,2004Biotechnology Letters,26:1487-1491）

所述羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因来自于Enterococcus菌属，为原核苷酸序列或在原序列中引入一处或多处改变以适应在真养产碱杆菌中表达的需要。

所述真养产碱杆菌优选真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16（来自德国微生物菌种保藏中心，编号DSM428）。

本发明还提供了一种经过遗传修饰真养产碱杆菌的构建方法，是在敲除phaC1基因的真养产碱杆菌中导入外源羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因。

更进一步，经过遗传修饰真养产碱杆菌的构建方法：

1）敲除真养产碱杆菌基因组上的phaC1基因（PHA合成酶基因）；

2）以质粒pBBRMCS-2为出发质粒构建穿梭质粒，将用于合成甲羟戊酸的羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因引入穿梭质粒；

3）将步骤2）构建的穿梭质粒导入步骤1）经过遗传修饰的真养产碱杆菌得到重组菌。

优选地，经过遗传修饰真养产碱杆菌的构建方法：

1）从野生型真养产碱杆菌H16出发，通过基因敲除技术敲除其基因组上的phaC1基因（PHA合成酶基因），降低其利用油脂类碳源合成PHA的能力。

2）以质粒pBBRMCS-2为出发质粒构建穿梭质粒，将用于合成甲羟戊酸的羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因引入穿梭质粒并导入大肠杆菌S17-1；

3）通过转导将穿梭质粒导入遗传修饰的真养产碱杆菌。

本发明还提供了一种利用经过遗传修饰真养产碱杆菌发酵生产甲羟戊酸的方法，技术方案如下：

1）敲除真养产碱杆菌基因组上的phaC1基因（PHA合成酶基因）；