[发明专利]一种以油脂为原料生产甲羟戊酸的方法及其构建的基因工程菌

权利要求书

1.一种产甲羟戊酸的真养产碱杆菌，是降低真养产碱杆菌将油脂类底物合成PHA的能力，提高油脂类底物经乙酰辅酶A至甲羟戊酸的碳代谢流比率。

2.如权利要求1所述真养产碱杆菌，其特征在于，是在敲除phaC1基因的真养产碱杆菌中导入外源羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因。

3.如权利要求1所述真养产碱杆菌，其特征在于，所述真养产碱杆菌为真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16，所述羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因来自于Enterococcus菌属，为原核苷酸序列或在原序列中引入一处或多处改变以适应在真养产碱杆菌中表达的需要。

4.如权利要求3所述真养产碱杆菌，其特征在于，所述羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因来自粪肠球菌。

5.权利要求1所述真养产碱杆菌用于发酵生产甲羟戊酸。

6.如权利要求5所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）敲除真养产碱杆菌基因组上的phaC1基因；

2）将羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因引入穿梭质粒；

3）将步骤2）构建的穿梭质粒导入步骤1）经过步骤1）遗传修饰的真养产碱杆菌得到重组菌；

4）步骤3）得到的重组菌利用油脂发酵生产甲羟戊酸。

7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述羟甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因来自于Enterococcus菌属，为原基因序列或在原序列中引入一处或多处突变以适应在真养产碱杆菌中表达的需要。

8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述真养产碱杆菌为真养产碱杆菌Ralstonia eutrophaH16。

9.如权利要求6所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）根据已经公布的真养产碱杆菌Ralstonia eutropha H16基因组信息，找到phaC1基因上下游各500个碱基的基因序列合并为1千个碱基的序列，根据序列信息化学合成约1千碱基的线性DNA片段如SEQ ID NO.1所示，序列两端含有15bp和质粒pJQ200mp18Km相同的同源臂；将通用质粒pJQ200mp18Km和合成的线性DNA片段重组为新质粒pGY46，将pGY46通过传统的热激转化法转入大肠杆菌S17-1，而后通过细菌转导的方式将pGY46通过大肠杆菌S17-1导入Ralstonia eutropha H16进行phaC1基因敲除；

2）根据已经公布的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）合成酶基因和羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的全长序列信息，对两个序列进行优化使之适用于在真养产碱杆菌中进行表达，优化后的序列为mvaZ1；根据mvaZ1进行化学合成，合成时分别在序列的两端分别加上15bp和质粒pBBR1MCS-2相同的同源臂序列；将重组mvaZ1片段和通用表达质粒pBBR1MCS-2不含lacZ基因的序列重组为新表达载体pBBR-mvaRZ，重组载体pBBR-mvaRZ核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3）将表达载体pBBR-mvaRZ通过传统的热激转化法转入大肠杆菌S17-1，而后通过细菌转导的方式将表达载体pBBR-mvaRZ通过大肠杆菌S17-1导入遗传修饰过的真养产碱杆菌来构建产甲羟戊酸的工程真养产碱杆菌；

4）利用步骤3）得到的重组菌以油脂为原料发酵生产甲羟戊酸。

10.权利要求5所述方法在发酵生产以甲羟戊酸为中间代谢产物产品中的应用。