[发明专利]一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌工程菌及其应用，特别是一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

维生素C(Vitamin C，VC)，又称为抗坏血酸(Ascorbic acid)，是一种人体必需的维生素和抗氧化剂，广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等工业。目前国内维生素C工业化生产采用二步发酵法，在第二步混合菌发酵体系中，执行糖酸转化的微生物只有小菌，小菌单独生长很困难，需要与大菌共同培养才能正常生长。两种菌的发酵控制为生产工艺增加了很大困难，且小菌产酸性状不稳定，因而导致生产不稳定，经常因菌种退化造成倒罐，导致生产上屡屡遭受重大损失。我国维生素C发酵技术从山梨醇到2-KLG的发酵过程由3种细菌参与，势必在微生物代谢过程中造成底物和培养基的大量浪费，发酵过程分为两步不但延长了生产周期还造成能源和人力的大量浪费。因此，现有维生素C两步发酵工艺尚存在巨大技术进步的潜力。G.oxydans是二步发酵法生产2-KLG中第一步发酵过程常用菌种，通过基因工程手段将维生素C两步发酵有关基因转化到G.oxydans中构建得到一步发酵菌株，实现由山梨醇经单菌一步发酵生成2-KLG，解除了小菌对伴生菌依赖的问题，简化了维生素C生产工艺。

采用连接肽工程改造G.oxydans一步菌生产维生素C合成前体2-KLG国内未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌。

所述工程菌表达sdh、sndh基因，sdh、sndh基因通过连接肽进行连接。

所述sdh、sndh基因核苷酸序列如KVU-0203、NCBI登陆号为AEM40042.1，KVU-0095NCBI登陆号为AEM39934.1所示。

所述sdh、sndh融合基因克隆于G.oxydans-E.coli穿梭质粒载体pGUC1上。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种生产2-KLG的G.oxydans基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明的具体方案为：

1）根据本实验室对K.vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh、sndh（NCBI登陆号为AEM40042.1、AEM39934.1）基因序列设计引物克隆sdh/sndh基因或通过化学全合成获得基因，通过融合PCR将sdh和sndh以不同的连接肽进行连接；

2）将sdh、sndh融合基因与载体连接得到重组表达载体；

3）将得到的重组表达载体转化氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)后得到重组菌株。

下面是本发明技术方案的具体描述：

质粒及重组菌的构建

将本实验室对K.vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh及sndh基因序列分别以连有10种连接肽(GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、EAAAK、EAAAKEAAAK、EAAAKEAAAKEAAAK及SSSNNNNNNNNNN)的引物进行扩增，通过PCR融合后连接到克隆载体pMD19-T测序，同时将来源于G.oxydans的强启动子tufB进行扩增连接到克隆载体pMD19-T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到E.coli-G.oxydans穿梭质粒载体pGUC1，构建得到10个融合表达载体pGUC-tufB-sdh-GS-sndh、pGUC-tufB-sdh-GS₂-sndh、pGUC-tufB-sdh-GS₃-sndh、pGUC-tufB-sdh-PT-sndh、pGUC-tufB-sdh-PT₄-sndh、pGUC-tufB-sdh-PT₇-sndh、pGUC-tufB-sdh-EAK-sndh、pGUC-tufB-sdh-EAK₂-sndh、pGUC-tufB-sdh-EAK₃-sndh及pGUC-tufB-sdh-S₃N₁₀-sndh。将构建好的重组表达载体转化E.coli JM109，菌落PCR验证阳性转化子(出现约3027bp的条带)，通过三亲本杂交的方法将重组表达载体转移至G.oxydans WSH-003中。

重组菌的种子培养及发酵