[发明专利]N-乙酰葡糖胺转移酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种N-乙酰葡糖胺转移酶突变体及其应用。

背景技术

近年来发现氨基糖类通常作为复杂寡聚糖和多糖类中的单体残基。氨基葡萄糖是单糖葡萄糖的氨基衍生物。N-乙酰氨基葡萄糖是葡糖胺的乙酰衍生物。葡糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖和其他氨基糖类是许多天然多糖的重要组成部分。

将氨基葡糖制成营养药品用于治疗动物和人的骨关节病等疾病。N-乙酰氨基葡萄糖也是治疗多种疾病的有价值的药物活性剂。由于N-乙酰氨基葡萄糖是动物体内蛋白合成的有价值和重要的成分，因此它对组织再生具有积极的影响，N-乙酰葡萄糖在预防和治疗各种疾病方面具有治疗潜能，诸如胃炎、食物过敏、炎症性肠病（IBD）、憩室炎、急性和慢性形式的类风湿性关节炎和骨关节炎，以及因骨关节组织代谢疾病导致的病理情况。

由于工业生产的氨基葡萄糖不能适宜于所有的人，来源于有壳的水生动物的氨基葡萄糖，对海鲜过敏的人群是不适宜的，越来越多的消费者寻找不含有动物副产物的物质，N-乙酰氨基葡萄糖没有任何已经确定的副作用。通过发酵生产获得氨基葡萄糖的过程中，氨基葡萄糖的积累对微生物代谢是有害的，因此只有通过发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖，再对其进行水解即可获得氨基葡萄糖。

发明内容

本发明的目的是提供一种N-乙酰葡糖胺转移酶突变体及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种N-乙酰葡糖胺转移酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

与野生型的N-乙酰葡糖胺转移酶相比，本发明的N-乙酰葡糖胺转移酶突变体发生改变的氨基酸序列为：F38S（第38位苯丙氨酸变为丝氨酸），P64T（第64位脯氨酸变为苏氨酸），I131N（第131位异亮氨酸变为天冬酰胺）。

本发明还提供编码所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的基因，其核苷酸序列为：

i）Seq ID No.2所示的核苷酸序列；或

ii）Seq ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii）在严格条件下与Seq ID No.2所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

本发明还提供含有编码所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体基因的载体、工程菌及转基因细胞系。优选地，所述工程菌的出发菌株为大肠杆菌。

本发明还提供所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体在N-乙酰氨基葡萄糖合成中的应用。

本发明进一步提供一种利用大肠杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖的方法，通过在大肠杆菌中过表达编码所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的基因，从而提高N-乙酰氨基葡萄糖的发酵产量。

所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的筛选方法，包括以下步骤：

（1）由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C，扩增N-乙酰葡糖胺转移酶（GNA1）的编码基因gna1；

（2）采用易错PCR技术，以基因gna1为模板，扩增获得GNA1突变体基因；

（3）将步骤（2）所得易错PCR产物及表达质粒pET28b用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB（Kan）平板，即得构建好的重组GNA1基因突变库；

（4）将LB（Kan）平板上长出的菌落一一对应转入LB（Kan）液体培养基中，置37℃摇床培养，待OD₆₀₀值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，37℃继续培养12h，然后分别离心收集菌体，破碎，测定GNA1酶活力，挑选酶活力最强的一株，并测定其基因序列，结果SEQ ID NO.2所示。

其中，所述野生型N-乙酰葡糖胺转移酶具有SEQ ID NO.3所示的基因序列和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

1）PCR扩增编码所述N-乙酰葡糖胺转移酶突变体的基因；

2）将步骤1）所得PCR产物连接表达载体pET-28b；

3）连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物；