[发明专利]一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液及其制备方法

权利要求书

1.一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：包括以下重量份数的原料：黄芪提取液2～4份、鸡α-干扰素注射液6～8份。

2.根据权利要求1所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：所述黄芪提取液是由以下方法制备的：

1）将黄芪粉碎至颗粒粒径为250～300μm，按照黄芪与水的质量比为1:6～10的比例将黄芪浸于蒸馏水中，在60～75℃条件下进行恒温微波提取，得混合物A；

2）将混合物A进行离心分离，取上清液，用活性炭进行脱色，得混合物B；

3）将混合物B浓缩至比重为1.15～1.25，得混合物C；

4）向混合物C中加入6～8倍体积量的乙醇溶液，搅拌使其混合均匀后，进行离心分离，取沉淀物并用蒸馏水稀释至比重为1.05～1.15，得混合物D；

5）将混合物D进行凝胶层析，收集吸收峰为280nm的层析后洗脱液，即得黄芪提取液。

3.根据权利要求2所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：步骤1）中所述微波提取的功率为250W，重复提取3～4次，每次提取时间为11～15min。

4.根据权利要求2所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：步骤2）中所述离心分离的转速为3000～5000rpm，时间为12～16min；步骤4）中所述离心分离的转速为3000～5000rpm，时间为12～16min。

5.根据权利要求2所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：步骤4）中所述乙醇溶液中乙醇的质量分数为70%～95%。

6.根据权利要求2所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：步骤5）中所述凝胶层析所用凝胶为葡聚糖凝胶，层析柱的内径与高度比为1:30～50；所述凝胶层析的洗脱液为蒸馏水，流速为0.3～0.6ml/min。

7.根据权利要求1所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：所述鸡α-干扰素注射液是由以下方法制备的：

a.取含有重组鸡α-干扰素蛋白的菌液，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤后，再用PBS缓冲液重悬，超声使菌体破壁后，离心并收集沉淀物；

b.将步骤a所得沉淀物用PBS缓冲液洗涤后，用变性缓冲液溶解包涵体，离心收集上清液，得变性蛋白溶液；

c.将步骤b所得变性蛋白溶液加入复性缓冲液中，4℃静置48h后，离心收集上清液，得含有重组鸡α-干扰素蛋白的溶液；

d.从重组鸡α-干扰素蛋白的溶液中收集重组鸡α-干扰素蛋白，进行蛋白处理后，加入保护剂溶液进行混合，使重组鸡α-干扰素的含量为10⁸～10⁹IU/100ml，即得鸡α-干扰素注射液。

8.根据权利要求7所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：所述变性缓冲液的pH为8.5，含有6mol/L盐酸胍、2mmol/L EDTA、50mmol/L Tris·Cl、10mmol/L DTT；所述复性缓冲液的pH为8.0，含有0.5mol/L L-Arg、2mmol/L EDTA、体积分数为20%的甘油、0.9mmol/L GSSG、0.1mol/L Tris·Cl。

9.根据权利要求7或8所述的用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液，其特征在于：所述含有重组鸡α-干扰素蛋白的菌液是由以下方法制备的：

i）菌体培养阶段：将发酵培养基高温灭菌后，加入1ml、浓度为100mg/ml的Amp，按体积百分比为5%～10%的量接入含有重组鸡α-干扰素蛋白的发酵用种子液，37℃培养8～10h，培养过程中维持pH为7.2，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧上升至30%，补加发酵培养基；

ii）碳源饲喂阶段：碳源消耗完后，流加补料培养基，使溶氧维持在30%以上，培养过程中维持pH为7.2；

iii）诱导表达阶段：继续流加补料培养基，加入IPTG至终浓度为0.5mM，诱导表达目的蛋白，培养过程中维持pH为7.2，溶氧维持在30%以上，诱导4h，得发酵液，即为含有重组鸡α-干扰素蛋白的菌液。

10.一种用于治疗禽类病毒性疾病的复方注射液的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

A.制备黄芪提取液：

1）将黄芪粉碎至颗粒粒径为250～300μm，按照黄芪与水的质量比为1:6～10的比例将黄芪浸于蒸馏水中，在60～75℃条件下进行恒温微波提取，得混合物A；

2）将混合物A进行离心分离，取上清液，用活性炭进行脱色，得混合物B；

3）将混合物B浓缩至比重为1.15～1.25，得混合物C；

4）向混合物C中加入6～8倍体积量的乙醇溶液，搅拌使其混合均匀后，进行离心分离，取沉淀物并用蒸馏水稀释至比重为1.05～1.15，得混合物D；

5）将混合物D进行凝胶层析，收集吸收峰为280nm的层析后洗脱液，即得黄芪提取液；

B.制备鸡α-干扰素注射液：

a.取含有重组鸡α-干扰素蛋白的菌液，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗涤后，再用PBS缓冲液重悬，超声使菌体破壁后，离心并收集沉淀物；

b.将步骤a所得沉淀物用PBS缓冲液洗涤后，用变性缓冲液溶解包涵体，离心收集上清液，得变性蛋白溶液；

c.将步骤b所得变性蛋白溶液加入复性缓冲液中，4℃静置48h后，离心收集上清液，得含有重组鸡α-干扰素蛋白的溶液；

d.从重组鸡α-干扰素蛋白的溶液中收集重组鸡α-干扰素蛋白，进行蛋白处理后，加入保护剂溶液进行混合，使重组鸡α-干扰素的含量为10⁸～10⁹IU/100ml，即得鸡α-干扰素注射液；

C.取步骤A所得黄芪提取液2～4重量份、步骤B所得鸡α-干扰素注射液6～8重量份进行混合，即得。