[发明专利]还原敏感偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途

说明书

技术领域

本发明属于化学合成和生物化学领域，涉及可用于DNA合成测序的化合物，具体涉及一类还原敏感型偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。

背景技术

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。

合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3′-羟基阻断外，为了不影响下一个指示核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如荧光素，连接起来。然后，在下一个指示核苷酸并入之前，在温和的条件下使这个连接单元断裂，继续DNA链的延长，从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(二硫键，偶氮化合物)；光裂解(邻硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基酯衍生物及其它光可裂解连接单元)；亲电子试剂／酸敏感(酸裂解；叠氮化合物)；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。然而还原敏感连接单元却从来没有用于DNA测序(Bioorganic&Medicinal Chemistry2012，20，571-582)。

可裂解连接单元对DNA测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。文献(Eur.J.Org.Chem.2010，4360-4364)报道了不同的偶氮苯为还原性连接单元应用于蛋白质组学，不同的偶氮化合物在连二亚硫酸钠作用下有很好的裂解速率，而还原剂对DNA链没有损伤，还未有报道偶氮化合物作为可裂解连接单元应用于DNA测序上，所以设计、合成对还原敏感的连接单元并用于DNA测序具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种还原敏感偶氮连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。本发明设计合成的一类新的还原敏感偶氮连接单元(可逆终端)，该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成；该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解，具有应用于DNA测序的价值。所以，基于偶氮结构的连接单元在DNA测序体系中能够提高测序效率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种还原敏感偶氮连接单元，其结构式如式(I)所示：

其中m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数。

优选的，所述m为0～10中任一整数，n为0～10中任一整数。

优选的，所述m=1，n为0～10中任一整数。

第二方面，本发明涉及一种上述的还原敏感偶氮连接单元的合成方法，包括如下步骤：

第一步、在DMF(N，N-二甲基甲酰胺)存在的条件下，碳酸钾、化合物E和化合物G反应，得到化合物H所述碳酸钾、化合物E和化合物G的摩尔比为(1.0～1.5)：(3.0～5.5)：1.0。

第二步、在冰浴的条件下，TFA(三氟乙酸)和化合物H反应，得到化合物I所述TFA和化合物H的摩尔比为(3.0～8.0)：1.0。

优选的，所述化合物E的合成包括如下步骤：

A、在甲苯存在的条件下，摩尔比为(1.0～3.5)：1.0的48％HBr水溶液与化合物A反应，得到化合物B其中，n为0～44中任一整数；

B、在氨水存在条件下，化合物B和氨水反应，得到化合物C所述氨水与化合物B的摩尔比为(1.0～30)：1.0；