[发明专利]人表皮细胞生长因子核酸序列及大肠杆菌表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和多肽类药物生产领域，尤其是涉及一种人表皮细胞生长因子核酸序列及大肠杆菌表达载体。

背景技术

人表皮细胞生长因子（Human epidermal growth factor,hEGF），是由53个氨基酸组成的多肽，分子量为6200道尔顿，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用，具有重要的临床应用价值。医学临床研究结果表明，hEGF可促进皮肤表层，内皮细胞和毛细血管生长，可应用于皮肤溃疡、烧烫伤，眼角膜损伤及手术创面等的修复和愈合（参考文献1：Hardwicke J,Schmaljohann D,Boyce D.et al.Epidermal growth factor therapy and wound healing-past,present and future perspectives,Surgeon.2008,6(3)：172-177;参考文献2：Jorge B,Jorge G,Pedro L,et al.Epidermal growth factor in clinical practice–a review of its biological actions,clinical indications and safety implications，International Wound Journal，2009,6(5)：331–346）。此外，随着人年龄增长，表皮细胞活性降低，皮肤新陈代谢减缓，逐渐引起皮肤的老化和损伤，而应用hEGF可促进表皮细胞生长，起到皮肤抗衰老作用，因而也被作为天然活性成分添加于高档护肤品当中。

人表皮细胞生长因子（hEGF)基因编码序列公布在GenBank数据库中的序号为X04571，人表皮细胞生长因子活性肽对应的核酸位置为3347～3505，多肽链的相对位置在AA949～1001。

国内外虽然已有报道根据hEGF基因序列在大肠杆菌(E.coli)中的表达（参考文献3：中国专利CN100362103C；参考文献4：中国专利CN102344924A），但存在产量低、纯化成本高、难以获得规模效益等难题。

大肠杆菌ChpA基因编码一个限制性核糖核酸酶，专一识别并切割核糖核酸（mRNA）的ACA序列。ChpA的表达将迅速降解大多数含有ACA序列的mRNA。在大肠杆菌中mRNA出现ACA的几率是相当高的，理论上平均每64个核苷酸长度就可能出现一个ACA序列。因此在特定生理条件下ChpA的基因过量表达是大肠杆菌的一种应激反应，使大肠杆菌进入一种生理状态，在这种状态下，绝大多数mRNA因为含有ACA序列将被降解而无法转译成新的蛋白，而细菌的其他代谢功能还可维持。ChpA作为限制性核糖核酸酶的这一功能可以被应用于本发明的hEGF生产系统。

将ChpA基因亚克隆于pBAD22a表达载体，置于BAD启动子下游，由阿拉伯糖进行诱导操控，获得pBADM载体。

依据人表皮细胞生长因子(hEGF)基因序列，对其ACA部分进行突变，并适当参照大肠杆菌优选密码子，设计并合成了不含ACA序列的人表皮细胞生长因子基因(hEGF-ACA-)，并克隆到pBADM质粒，获得pBADME并转化到大肠杆菌BL21中进行发酵。

大肠杆菌BL21菌株的pBADME转化子经IPTG与阿拉伯糖双诱导，ChpA与hEGF-ACA-共表达，结果菌体内大量含ACA密码子的新生mRNA被ChpA降解，而hEGF-ACA-的mRNA不受影响，并持续翻译成hEGF蛋白。该技术优势在于将重组细菌中的翻译系统集中用于目标蛋白hEGF的表达，使翻译效率提高。经实验证实，应用所合成的序列配合含ChpA的表达载体，可获得hEGF在大肠杆菌系统中的高表达。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种新的人表皮细胞生长因子DNA序列。

本发明的第二目的是提供大肠杆菌表达载体pBADME。

本发明的第三目的是提供利用pBADME大肠杆菌转化子制备人表皮细胞生长因子的方法。

所述新的人表皮细胞生长因子DNA(hEGF-ACA-)，具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列。该核苷酸序列共有162个核苷酸，由人工合成获得，其中，最后3个TAA为终止密码子。与公布的人表皮细胞生长因子DNA(SEQ ID No.2)比较，有2个碱基不同。(除外加TAA终止密码子外）分别是第81个碱基与第111个碱基的胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）。