[发明专利]人表皮细胞生长因子核酸序列及大肠杆菌表达载体

权利要求书

1.人表皮细胞生长因子DNA(hEGF-ACA-)，其特征在于具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列，该核苷酸序列共有162个核苷酸，由人工合成获得，其中，最后3个TAA为终止密码子，除外加TAA终止密码子外，分别是第81个碱基与第111个碱基的胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）。

2.大肠杆菌表达载体pBADME，其特征在于包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体，所述载体是包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的表达载体pBADME；其质粒共表达不含ACA序列的人表皮细胞生长因子基因hEGF与专一识别ACA序列的限制性核酸内切酶基因ChpA。

3.如权利要求2所述大肠杆菌表达载体pBADME的构建方法，其特征在于其具体步骤如下：

将ChpA基因亚克隆于pBAD22a表达载体，置于BAD启动子下游，由阿拉伯糖进行诱导操控，获得pBADM载体；依据人表皮细胞生长因子(hEGF)基因序列，对其ACA部分进行突变，并适当参照大肠杆菌优选密码子，设计并合成了不含ACA序列的人表皮细胞生长因子基因(hEGF-ACA-)，并克隆到pBADM质粒，获得pBADME。

4.利用pBADME大肠杆菌转化子制备人表皮细胞生长因子的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

1)根据人表皮细胞生长因子hEGF全长序列设计引物，并替换掉密码子中的ACA序列以获得不含ACA序列的hEGF基因，再将hEGF-ACA-基因序列克隆进入pBADM载体，重组成表达载体pBADME；相应表达出的重组蛋白hEGF与人体表皮细胞生长因子在氨基酸序列上一致；

2)将步骤1)中构建好的表达载体pBADME分别转化至大肠杆菌BL-21/JM109，在35℃下，250rpm.培养至OD₆₀₀达到3.0，以l∶100接种到新鲜培养基继续培养至OD₆₀₀达到0.5，将温度调到30℃，用IPTG与阿拉伯糖双诱导16～20h，IPTG诱导浓度范围为0.1～1mmol；阿拉伯糖诱导浓度范围为0.01%～0.1%，得到高产量的人表细胞皮生长因子。

5.如权利要求4所述利用pBADME大肠杆菌转化子制备人表皮细胞生长因子的方法，其特征在于在步骤1)中，所述pBADME载体含有受阿拉伯糖诱导的限制性核酸内切酶ChpA的表达盒，同时含有受IPTG诱导的人表皮细胞生长因子hEGF-ACA-表达盒。

6.如权利要求4所述利用pBADME大肠杆菌转化子制备人表皮细胞生长因子的方法，其特征在于在步骤2)中，所述IPTG与阿拉伯糖双诱导后，所表达的ChpA将降解细胞内大多数含ACA序列的mRNA，而对于hEGF-ACA-基因的mRNA没有影响。