[发明专利]用于DNA断裂和标记的固定化的转座酶复合体

说明书

本发明提供了用于制备高度适用于断裂DNA的纯化的转座酶复合体的简单和迅速的方法。所述方法包括在细胞裂解物中形成转座酶与寡核苷酸衔接子的复合体，然后从所述细胞裂解物中的其它物质中将该复合体纯化出来。纯化使用特异性结合对完成，其中所述对的一个成员结合于复合物的寡核苷酸衔接子，而所述对的另一个成员结合于固体基质。结合的复合体可以立即在DNA断裂反应中使用以产生结合于固体基质的DNA片段，后者可以用于任意目的，包括用作扩增和测序的模板。

对相关申请的交叉引用

本申请依赖在2012年10月1日提交的美国临时专利申请号61/708,332的提交日并要求其的权益，通过提述将该文献的全部公开内容并入本文。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。更加具体地，本发明涉及具有转座酶的组合物，所述转座酶通过特异性结合对（specific binding pair）联接的方式在粗制细胞裂解物中与寡核苷酸衔接子(adapter)复合或结合至固体支持物，本发明还涉及所述转座酶/寡核苷酸复合体在该复合体的纯化中的用途，以及所述复合体用于制备体外扩增用的DNA分子、核酸分子测序、以及在DNA文库中筛选感兴趣的序列的用途。

背景技术

基因组DNA的断裂是高通量测序的DNA样品制备中的关键步骤，高通量测序也称为下一代测序(next generation sequencing)或NGS。原来使用的样品制备方法，如使用DNA酶I的DNA断裂，非常不可靠，且经常导致DNA断裂不足或过度。在两种情况中，有用大小（大约200-800碱基对（bp））的DNA片段的产率都是较低的。使用超声破碎仪（sonicator）的DNA剪切法提供了另外的选择，超声破碎仪的例子有来自Covaris(Woburn,MA)的E220和E220x仪器。然而，这类仪器非常昂贵（2012年价格超过100,000美元）且整个DNA剪切法是劳动密集和多步骤的过程。其牵涉DNA断裂、片段末端修复（fragments ends repair）、第一片段纯化（first fragments purification）、加poly-A尾（poly-A tailing）、衔接子连接（adapter ligation）、第二片段纯化（second fragments purification）、PCR扩增（PCRamplification）、以及第三片段纯化（third fragments purification）。使用寡核苷酸-转座酶复合体，如来自Illumina(San Diego,CA)的NEXTERA^TMDNA样品制备试剂盒，可以将数个步骤省去一半。试剂盒所提供的寡核苷酸-转座酶复合体可以在一个反应中既实现受控的DNA断裂，又实现衔接子的连接，该反应仅需要几分钟。这类复合体包括一个修饰的Tn5转座酶二聚体和一对Tn5-结合性双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）寡核苷酸，所述寡核苷酸含有19bp的转座酶结合序列，或反向重复序列（inverted repeat sequence，IR）。在NEXTERA^TM系统中，使用一种工程改造的、非天然的19bp转座酶结合序列，其提供了比天然Tn5IR序列更加有效的DNA断裂。这种结合序列称为“镶嵌体（mosaic）”。

不像DNA酶那样单个分子就能在靶DNA中产生多处断裂，转座酶复合体据信每个复合体只产生一个DNA断裂。因此和DNA酶I不同的是，通过控制反应混合物中转座酶复合体与靶DNA的比例，在转座酶断裂期间DNA断裂的程度是容易控制的。而且，在这种转座酶介导的DNA断裂过程中可以附接上与所述镶嵌体序列组合的特异性核苷酸标签，这对于PCR中的DNA扩增和将DNA片段附加至测序芯片是有用的。尽管在成本、时间和劳力方面有明显的优势，但转座酶方法不如超声破碎法使用得频繁，因为它所导致的靶DNA的断裂不是完全随机的（偏倚（bias））。