[发明专利]检测Galectin-3的纳米磁珠分选-时间分辨免疫荧光试剂盒

说明书

 

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及一种纳米磁珠分选和时间分辨免疫荧光的串联检测方法，具体为运用纳米磁珠与Galectin-3抗体偶联来特异性捕获检测样品中Galectin-3蛋白，然后应用时间分辨免疫荧光方法进一步检测所捕获Galectin-3蛋白的浓度。人外周血中Galectin-3蛋白浓度的增加与胰腺癌的发生发展存在密切关联，运用本试剂盒能够对胰腺癌的发生发展起到诊断作用，实现对血清标本的重复使用，并能提高对血清Galectin-3的检测灵敏度。

 

背景技术

Galectin-3是一种半乳糖凝集素，表达于细胞质、细胞膜和线粒体上，并能够被分泌到细胞外间质。它具有CRD结构域，能识别特异性糖蛋白和糖脂，参与多种生理和病理过程，包括细胞生长和凋亡、细胞黏附及新生血管形成。我们运用MALDI-TOF-MS质谱技术发现Galectin-3在人胰腺癌组织中呈现高表达，并且它的表达水平与胰腺癌的分期及预后相关。我们的研究发现，正常人、胰腺癌和其它消化系统肿瘤外周血清中均未检测出Galectin-3蛋白，而胰腺癌患者外周血清中的Galectin-3阳性率高达为30％。因此，Galectin-3对胰腺癌具有明确的诊断价值。

时间分辨免疫荧光检测方法是一种成熟的免疫分析方法，具有高特异、高灵敏的优点，是在临床医学和检验医学等诸多方面得到十分广泛的应用，是目前取代放射性免疫分析的一种定量检测方法。它的基本原理是利用三价稀土离子（如Eu³⁺）作为示踪物，延迟检测寿命较长的特异性激发荧光以排除非特异性及背景荧光的干扰，即测定复合物中的稀土离子被激发的延迟荧光强度，从而确定待测蛋白的浓度。

然而，时间分辨免疫荧光需要消耗一定数量的血清，并且该血清不可重复使用，因此患者提供的血清仅能检测有限的指标，这也对临床血清标本库的建立和使用形成一大限制。如何使得患者提供的血清能够无限次地检测不同的标志物，这是一个对临床和科研都具有意义的研究问题。因此，我们开发了纳米磁珠分选－时间分辨免疫荧光串联分析方法，首先通过包被有Galectin-3的纳米磁珠来吸附富集血清中（如500微升血清）Galectin-3蛋白，然后将收集到的Galectin-3蛋白释放到一个微小体积的检测液中（如5微升），使得样本一次浓缩100倍，从而将检测灵敏度提高了2个数量级。并且，对于同一个检测样本，可以用不同抗体标记的纳米磁珠先后进行富集筛选，从而达到高通量检测的目的。

本发明将纳米磁珠分选和时间分辨免疫荧光检测串联起来，初步实现了对患者血清的重复使用目的，并且提高了灵敏度高，为临床的肿瘤标志物检测和TRFIA高通量检测提供了良好的平台。

目前，国际上还没有相关报道，更没有专门用于检测Galectin-3的纳米磁珠分选－时间分辨免疫荧光试剂盒提供，因此，该试剂盒的开发和应用，是填补了这方面的空白。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种能够使得被检测样本可以重复利用的、并且灵敏特异的检测试剂盒，以此来确定样本中Galectin-3蛋白浓度。

本发明的目的是通过以下方法实现的：用Galectin-3抗体偶联30nm粒径的超顺磁性复合微粒，在500微升检测样品中捕获富集目的蛋白，洗涤后加入检测抗体孵育，随后加入Eu^3＋标记的链亲和霉素孵育，再次洗涤后释放该磁珠至检测板中，并加入荧光增强液，振荡5分钟后用337nm波长光激发，延时200微秒在615nm波长处检测发射荧光值；通过标准品的浓度和相应的荧光值绘制标准曲线，待检样品中的Galectin-3浓度就可以通过它的荧光值并对应标准曲线得到。

本发明检测Galectin-3的纳米磁珠分选-时间分辨免疫荧光试剂盒，其包括以下组成：

（1）30nm粒径的超顺磁性复合微粒；

（2）偶联缓冲液；

（3）磷酸盐缓冲液（PBS），其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl， 10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH值为7.4；

（4）封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（5）洗涤液为含0.05%Tween-20的Tris-HCl 缓冲液（TBS），其成分为50mM的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8），0.05%Tween-20；