[发明专利]检测Galectin-3的纳米磁珠分选-时间分辨免疫荧光试剂盒

权利要求书

1.检测Galectin-3的纳米磁珠分选-时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于包括以下组成：

（1）30nm粒径的超顺磁性复合微粒；

（2）偶联缓冲液；

（3）磷酸盐缓冲液（PBS），其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl， 10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH值为7.4；

（4）封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（5）洗涤液为含0.05%Tween-20的Tris-HCl 缓冲液（TBS），其成分为50mM的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8），0.05%Tween-20；

（6）加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；

（7）荧光增强液（Enhancement Solution）；

（8）检测缓冲液（Assay Buffer）为50mM的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8），其中含有1%BSA，1%bovine globulin，0.05%Tween 40，DTPA； 

（9）包被抗体为单克隆小鼠抗人Galectin-3抗体（Monoclonal Anti-Human Galectin-3 Antibody），储存浓度为1μg/μl；

（10）检测抗体为生物素化的羊抗人Galectin-3多抗（Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody），储存浓度为50ng/μl；

（11）Eu^3＋标记的链亲和霉素（Eu^3＋-labeled streptavidin），储存浓度为0.1μg/μl；

（12）标准品，重组人Galectin-3蛋白（Recombinant Human Galectin-3），浓度为100μg/μl。

2.如权利要求1所述检测Galectin-3的纳米磁珠分选-时间分辨免疫荧光试剂盒的使用方法，其特征在于以下步骤：

（1）用1ml偶联液溶解500μg单克隆小鼠抗人Galectin-3抗体，加入30nm粒径的超顺磁性复合微粒，轻摇混匀，置于恒温摇床，37℃、180 rpm 振荡反应20min。反应完毕，磁性分离2 min； 

（2）在上述离心管中加入1 ml 洗涤液，轻摇混匀，磁性分离，重复该清洗操作1次；

（3）在离心管中加入3 ml封闭液，置于恒温摇床，37℃、180 rpm 振荡反应2 h。磁性分离，弃上清。

（4）在离心管中加入1 ml 洗涤液，轻摇混匀，磁性分离，弃上清。重复该清洗操作3次；

（5）在500μl待测培养上清样品和倍比稀释的标准品中加入纳米磁珠偶联的抗体2μl，混合均匀，置于37℃摇床180rpm，1h；

（6）将上述1.5ml Ep管置于磁性分离器上，磁性分离2min，然后将500ul血清全部取出后冻存；

（7）将上述1.5ml Ep管置于磁性分离器上，用500μl PBS-0.05%Tween20洗涤三次；

（8）加入稀释好的检测抗体Biotinylated Anti-Human Galectin-3 Antibody（Detect Antibody）100μl/管，混合均匀，置于37℃摇床180rpm，1h；

（9）将上述1.5ml Ep管重新置于磁性分离器上，磁性分离2min，然后弃去检测抗体，用500μl Wash Buffer洗涤三次；

（10）加入用Assay Buffer 配制的Eu-labeled streptavidin 100μl/孔，混合均匀，置于37℃摇床180rpm，避光，1h；

（11）将上述1.5ml Ep管重新置于磁性分离器上，磁性分离2min，然后弃去Eu-labeled streptavidin，500μl/孔Wash Buffer洗涤四次； 

（12）加入Enhancement Solution 200μl/孔，混合均匀后，将200μl液体加于96孔检测板中，室温避光孵育45min并Slowly Shaking 5min；

（13） 读板：设定激发光波长（Excitation wavelength）为337nm，发射光波长（Emission wavelength）为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；

（14）利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；

（15）通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的Galectin-3的浓度。