[发明专利]检测DNMT3A突变位点的方法、引物和试剂盒

说明书

   

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，涉及检测DNMT3A第882位多态性突变的方法、引物和试剂盒。采用普通PCR技术进行扩增，再进行测序，就可确定检测急性粒细胞白血病（AML）患者体内DNMT3A 第882位多态性突变情况。

 

背景技术

急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一类由造血祖细胞分化受阻及增殖异常而导致的血液系统恶性肿瘤，近年来在AML中鉴定出了多种有重要预后价值的分子标记，由基因突变导致的细胞增殖、分化和细胞凋亡途径的改变是AML的发病基础。其中，新近的研究热点DNA甲基转移酶3A基因(DNA-methyltransferase 3 alpha，DNMT3A)编码DNA甲基转移酶3A，在DNA甲基化过程中起催化作用，而现今普遍认为DNA的甲基化水平与肿瘤的发生高度相关。DNMT3A基因的突变在AML患者中高达20%，经大量临床随访研究提示该基因发生突变与预后不良相关联。它的突变形式也多种多样，热点突变是发生于编码第第882位精氨酸的基因位点的错义突变，突变类型为R882位精氨酸变为组氨酸(R882H)、半胱氨酸(R882C)，脯氨酸(R882P)、丝氨酸(R882S)。

DNMT3A 突变已成为新的预后指标，有助于临床医师早期识别正常核型AML患者中的不同亚型，以便尽早地对患者进行有效治疗。

 

发明内容

本发明的目的是提供检测DNMT3A第882位多态性突变的方法、引物和试剂盒。采用普通PCR技术进行扩增，再进行测序，就可确定检测急性粒细胞白血病（AML）患者体内DNMT3A 第882位多态性突变情况。

本发明提供检测样品DNMT3A第882位多态性突变的引物，所述引物包括一对扩增引物，其碱基序列为：

DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG(SEQ ID NO.1)

DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA(SEQ ID NO.2)。

进一步地，所述引物还一对测序引物，其碱基序列为：

DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA。

进一步地，所述多态性突变选自R882H、R882C、 R882P和R882S。

本发明还提供一种检测样品DNMT3A第882位多态性突变的方法，所述方法包括：

(1)提取样品中的基因组DNA；

(2)利用一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；

(3)利用一对测序引物对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的基因序列；

(4)将(3)中的基因序列与DNMT3A野生型基因序列进行比较，确定所述多态性突变是否存在，其中

所述的一对扩增引物，其碱基序列为：

DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA 

所述的一对测序引物，其碱基序列为：

DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA 

本发明还提供一种检测样品DNMT3A第882位多态性突变的试剂盒，所述试剂盒包括样品基因组DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

进一步地，所述检测体系PCR反应液包括dNTPs、KOD FX DNA Polymerase和一对扩增引物DNMT3A882-F和DNMT3A882-R，其中

DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA 

进一步地，所述测序体系反应液包括测序纯化反应液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和一对测序引物DNMT3A882-F和DNMT3A882-R，其中

DNMT3A 882-F: TTCGGCAGAACTAAGCAG

DNMT3A 882-R: GTCCCTTACACACACGCA