[发明专利]靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种整合外源DNA序列的方法和应用，特别是涉及一种靶向整合外源DNA序列到大鼠或小鼠Rosa26位点的方法及其应用。

背景技术

TALEN（Transcription Activator-like Effector Nuclease）技术是一种崭新的分子生物学工具。利用TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加内切酶结构域，TALEN蛋白可以靶向切割基因组DNA【Cermak T,Doyle EL,Christian M,et al.,Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs forDNA targeting.Nucleic Acids Res.2011.39(12):e82.】。在同源模板存在的情况下（Donor质粒），细胞会发生同源重组，从而高效精确地对基因组进行编辑【Zu Y,Tong X,Wang Z,et al.TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.Nat Methods.2013.10(4):329-31.】。TALEN技术可以广泛的应用于基因组编辑的各个方面：细胞水平的基因敲除，定点点突变，结构域缺失，定点整合等等，在疾病治疗领域具有广泛的应用前景【Sun N,Zhao H.Transcription activator-like effector nucleases(TALENs):a highly efficient and versatile tool for genome editing.Biotechnol Bioeng.2013.110(7):1811-21.】。

目前TALEN技术主要的缺陷是效率相对较低，一般在5%-20%，无法直接获取100%编辑的细胞，只能通过挑选阳性的单克隆细胞，扩增成为稳定株。

另外，当前在大鼠和小鼠细胞中构建定点整合稳定株还是基本采用如下的传统稳定株筛选方式:

1）线性化质粒筛选单克隆稳定株

2）慢病毒感染细胞筛选混合稳定株

这两种常用的方法都有严重的缺陷：质粒筛选稳定株的周期长，效率低，整合位点不确定，需要一直使用抗生素维持，容易导致非正常的细胞表型；慢病毒筛选稳定株周期较短，但是整合位点不确定且集中与一些高表达的热点区域，需要一直使用抗生素维持，同时慢病毒载体携带的病毒基因对细胞正常生理功能影响巨大。这些缺点使这两种方式筛选到的稳定细胞株不能有效的代表外源整合基因的生物学功能，造成一些实验上的假象，使实验结论没有说服力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用。本发明利用TALEN技术解决了上述传统方法的缺陷。同时本发明还实现了使用同一对TALEN质粒同时对小鼠和大鼠细胞Rosa26位点实现切割，配合各自的同源重组模板，实现对小鼠和大鼠细胞Rosa26位点基因定点整合任意外源DNA序列。

为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点，该TALEN识别Rosa26位点的上游识别序列如SEQ ID NO.1所示，下游识别序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，SEQ ID NO.1-2是一对同时存在于大鼠和小鼠Rosa26保守位点的序列。

本发明的第二方面，提供一种一对用于识别上述位点的TALEN质粒，该一对TALEN质粒是上游TALEN质粒和下游TALEN质粒，其中，上游TALEN质粒含有SEQ ID NO.3所示的碱基序列，下游TALEN质粒含有SEQ ID NO.4所示的碱基序列。

所述上游TALEN质粒优选为含有SEQ ID NO.3所示的碱基序列的HY-TALEN-Rosa26-U质粒（表达载体），下游TALEN质粒优选为含有SEQ ID NO.4所示的碱基序列的HY-TALEN-Rosa26-D质粒（表达载体）。

本发明的第三方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到小鼠的TALEN识别Rosa26位点的小鼠同源重组模板质粒，该质粒含有SEQ ID NO.5所示的碱基序列。