[发明专利]复合发酵制备几丁聚糖的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及几丁聚糖制备方法，属于制造领域。

背景技术

甲壳素是一种天然含氮多糖物质，广泛存在与无脊椎动物的外壳或角质层中，尤其是虾蟹类的外壳中。甲壳素很容易获得，可再生，是仅次于纤维素的天然均聚物，但是因分子内部有很强的氢键作用，溶解性低，应用范围受到限制。

甲壳素脱乙酰后生成壳聚糖。目前壳聚糖的制备多采用化学法和酶解法脱乙酰。化学法脱乙酰反应中，影响脱乙酰的因素很多，但是主要影响因素包括：碱液浓度、反应温度和时间。一般来说，提高反应温度和延长反应时间均可提高脱乙酰度，但是会导致甲壳素主链降解增加，从而影响产品的粘度和分子量。通入氮气可以在一定程度上减缓主链的降解。由于化学法使用的碱液浓度高，反应时间长，产品质量不稳定，环境污染严重。

酶解法不会降解主链，并且无污染，具有重要的研究开发价值。影响酶解的因素很多，主要包括PH值和温度。文献记载最适宜PH值4-8，最适宜温度30-70℃（《甲壳酶特性与应用研究》 万云洋等 《天然产物研究与开发》 2003 vol 15 No.6）。迄今为止发现的真菌甲壳质脱乙酰酶（CDA）都是糖蛋白，且有良好的热稳定性。但是不同来源CDA的存在位置、最适宜PH值（PH4.5-12）、碳水化合物含量、相对分子质量及离子影响等有较大的差异。

迄今报道的CDA基本都来源于真菌。真菌来源的CDA主要作用是自身细胞壁的合成，最适底物一般为甲壳寡糖，对甲壳质的活性较低，不适合用酶法脱乙酰生产壳聚糖。真菌来源的CDA来源广泛，获取容易，成本相对较低。因此如何能够将真菌来源的CDA用于制备壳聚糖成为本领域技术人员急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的几丁聚糖制备方法，所述的方法能够较现有技术更节能环保。

本发明的另一目的是提供一种用真菌来源的CDA制备几丁聚糖的方法，所述的方法能够解决现有技术CDA不适于生产几丁聚糖的技术难题。

本发明的另一目的是提供一种安全的几丁聚糖制备方法，所述的方法制得的几丁聚糖无强酸或强碱残留，产品更安全。

本发明的另一目的是提供一种具有市场竞争力的几丁聚糖，所述的产品不因工艺的改进而增加生产成本。

为达到上述目的，本发明采用下列技术方案实现：

干燥、粉碎、发酵；盐酸脱钙、脱蛋白，过滤；酶解脱乙酰、水洗干燥即得。

本发明采用制备方法对脱钙前的蟹壳或虾壳进行预处理，然后再进行酶解脱钙和脱蛋白。

为增强脱钙和脱蛋白效果，本发明优选的将蟹壳或虾壳粉碎至0.5～1.0mm颗粒，颗粒过小则增加生产成本，颗粒过大效果较差。发明人经过多次试验及经验，最终确定0.5～1.0mm颗粒范围达到脱钙和成本的最佳性价比。

发明人提供大量实验，意外发现多种乳酸菌按照一定的配比组合进行发酵后脱钙效果更好，而采用乳双歧杆菌（B .lactis）、保加利亚乳杆菌(L. bulgaricus)和瑞士乳杆菌(L. helviticus)三种乳酸菌进行发酵效果较好；采用此三种乳酸菌配比后发酵效果最好，当三种乳酸菌以重量比2:6:5进行组合时，发酵24～36h，游离钙含量较单一乳酸菌发酵后提高10%～20%。优选的，乳酸菌占蟹壳或虾壳原料重量比为0.02～0.06%。

本发明采用高温灭菌的方法达到杀菌消毒的目的，同时也去除乳酸菌。

发酵液过滤，留取残渣，滤液回收干燥制成生物有机钙。残渣中加入8～15%盐酸脱钙，充分反应后，过滤，水洗至中性，留取残渣。残渣中加入8～15%氢氧化钠溶液，80-100℃，1-3h，过滤水洗至中性。

脱钙和脱蛋白后，过滤，弃滤液，留取残渣，残渣即为甲壳质。将甲壳质加入含有甲壳质脱乙酰酶的发酵液脱乙酰，甲壳质与发酵液的重量体积比（g/l）1～3:1～6，30～32℃,48～72h，0.2MPa，然后120℃灭菌20min，干燥即得几丁聚糖。

所述的可以从公开市场上购得，也可以通过构巢曲霉菌发酵后制得。

所述的甲壳质脱乙酰酶制备方法如下：

（1）制备发酵培养基：酵母粉8g，壳聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氢钾2g，无水硫酸镁1g，二氯化钴（0.01mol/l）10ml，水1000ml；

（2）发酵条件：发酵培养基灭菌，接入构巢曲霉菌，30～35℃，PH6.0～7.0，72～96h。

经过脱钙和脱蛋白后，去除了原料中的钙离子、蛋白质其它有机物质。

本发明所述的几丁聚糖脱乙酰度高达96%以上。