[发明专利]锌离子胶体金层析快速检测试纸条或试纸卡及制备方法

权利要求书

1.一种锌离子胶体金层析快速检测试纸条，包括支撑板、样品垫、金标抗体结合垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护膜，其特征在于：所述样品垫、金标抗体结合垫、包被膜、吸水垫依次粘贴于支撑板上；金标抗体结合垫上包被有胶体金标记的能识别锌离子的单克隆抗体或多克隆抗体；包被膜上设有偶联锌离子的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，以及用羊抗小鼠IgG溶液印制的隐形对照印迹。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述支撑板为硬质塑胶条或不吸水的硬纸条；所述样品垫和金标抗体结合垫由玻璃纤维棉制成；所述吸水垫由吸水滤纸制成；所述包被膜由硝酸纤维素膜制成；所述载体蛋白为鸡卵清蛋白、血蓝蛋白或牛血清蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征是：所述保护膜覆盖在样品垫、金标抗体结合垫和吸水垫上，保护膜上印制有样品标记线，该样品标记线偏向样品垫一侧0.3-0.5cm处；隐形检测印迹上偶联六价锌离子的载体蛋白溶液的包被量为1μL/cm，载体蛋白浓度为1mg/mL；隐形对照印迹上羊抗小鼠IgG抗体的包被量为1μL/cm，抗体浓度为1mg/mL；所述隐形检测印迹和隐形对照印迹的排列方式为“︱︱”、“＋＋”或“●●”。

4.权利要求1所述锌离子胶体金层析快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：金标试纸条制备步骤如下：

（1）偶联锌离子载体蛋白溶液的制备：

称取20mg 载体蛋白溶于1mL、浓度为10mmoL/L、pH值为9.0的N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸的缓冲液中，形成载体蛋白溶液； 称取10mg对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶于1mL二甲基亚飒中，形成金属鳌合剂溶液；取100uL DTPA溶液在搅拌下逐滴加到0.5mL载体蛋白溶液中，用10mol/L的KOH调节其pH至9.0，室温反应24h，形成DTPA-载体蛋白溶液；称取100mg氯化锌溶于100μL浓硝酸中，加纯水溶解得到终体积为1mL、浓度为733.7mmoL/L的Zn²⁺溶液； 

将Zn²⁺溶液加入到DTPA-载体蛋白溶液中，调节其pH值至7.4，室温孵育4h，用PBS缓冲液透析10d，形成Zn²⁺-DTPA -载体蛋白人工抗原，收集分装，－20℃冻存；

（2）单克隆抗体的制备：用Zn²⁺-DTPA-载体蛋白免疫6周龄BALB/C小鼠，采用细胞融合技术，在PEG-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用ELISA法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，经扩大培养、冻存并鉴定，制备杂交瘤细胞株，之后采用体内诱生腹水法制备锌离子单克隆抗体；

（3）金标抗体制备： 

将待标记的锌离子单克隆抗体溶液10000r/min离心30min，取胶体金溶液10mL，用0.1 mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；取等量锌离子单克隆抗体溶液，磁力搅拌下与胶体金溶液混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用每升含10 g BSA、0.5 g叠氮钠、浓度为0.02 mol/L 的Na₂B₄O₇溶液稀释，即获得胶体金标记的锌离子单克隆抗体，4 ℃保存备用；

（4）金标抗体结合垫制备：按规格裁取玻璃纤维棉，将金标抗体用单向喷点仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存备用；

（5）隐形检测印迹和隐形对照印迹的制备：将Zn²⁺-DTPA-载体蛋白人工抗原放于单向喷点仪贮存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于贮存池B，开机分别点射于膜中央，形成间距0.5cm的隐形检测印迹和隐形对照印迹，自然干燥，密封，4℃保存备用；

（6）试纸条组装：将样品垫、金标抗体结合垫、包被膜和吸水垫按顺序依次粘贴于支撑板上，并在试纸条两端的表面粘贴保护膜，在切槽机上切割成试纸条。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：其中锌离子单克隆抗体与胶体金溶液的标记比为1∶5.2×10⁴，所得胶体金溶液中金颗粒的粒径为30 nm；所含羊抗小鼠IgG溶液的浓度为0.34μg/mL。