[发明专利]一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和发酵工程领域，尤其涉及一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法。 

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-amino1evulinic acid, ALA)广泛存在于生物体中，是生物体内四吡咯类化合物（如血红素、卟啉和维生素B₁₂等）的共同前体。5-氨基乙酰丙酸在农业上可用作光合作用促进剂、抗逆剂、落叶剂和除草剂等，用途广泛、对人畜无毒性，是极具发展前途的无公害绿色农用化学品。在医学领域，5-氨基乙酰丙酸作为新一代光动力学药物，在脑瘤、皮肤癌、膀胱癌和结肠癌等疾病的诊断和治疗方面有着极大的应用价值。基于ALA广阔的应用前景，其合成已引起广泛的重视。 

ALA的生产主要有化学合成法和生物合成法。前者步骤繁琐、副产物多且产率低；后者克服了前者的弊端，主要通过生物诱变法或基因工程法来实现。生物诱变法主要是优化类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)突变株，但其培养周期长，成本较高；基因工程法主要是构建含有ALA合成酶基因的工程菌，至今报道的ALA合成酶基因来源主要有类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris) 等。 

本发明利用E.coli Rosetta(DE3)表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus) hemA基因，通过胞内高活性表达ALA合成酶，进一步提高5-氨基乙酰丙酸的产量。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的荚膜红细菌hemA基因胞内高活性表达的方法是利用E.coli Rosetta(DE3)，表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌hemA基因。 

上述荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法，包括以下步骤： 

（1）从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA；

（2）PCR扩增ALA合成酶基因；

（3）采用双酶切法，将扩增得到的ALA合成酶基因与质粒pET28a连接，并转化至DH5α，筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemA的阳性克隆；

（4）将重组质粒pET28a-R.C.hemA转化至宿主菌Rosetta(DE3)中，筛选得到工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA。

（5）发酵培养工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA，使其胞内高活性表达荚膜红细菌hemA基因。 

本发明的有益效果是，本发明将一种含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌hemA基因接入表达载体pET28a获得的重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3)，在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作用下，实现胞内高活性可溶表达ALA合成酶。表达的ALA合成酶比活力高达198.2 nmol^-1min^-1mg of protein^-1，比现已投入工业化生产的含放射形土壤杆菌hemA基因的工程菌获得的ALA合成酶（151.1 nmol^-1min^-1mg of protein^-1）提高31.2%。经初步优化后，将其应用于生产，胞外ALA产量高达8.61 g/L，处于国际化领先水平。 

附图说明

图1是重组质粒pET28a-R.C.hemA的构建图；图中，R.C.hemA为荚膜红细菌hemA基因，kana+为卡那霉素抗性基因，HindⅢ和NdeI为限制性内切酶位点。 

图2是工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA发酵、诱导表达、纯化得到的ALA合成酶的电泳图。 

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将更加明显。