[发明专利]含BMP-2和ZsGreen1基因的表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及BMP-2表达载体及其构建，尤其涉及一种含BMP-2和ZsGreen1基因的表达载体及其构建方法。

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)包括一系列结构和功能相似的多肽，其中BMP-1是骨生长调节因子并属于金属肽链内切酶家族，其余BMP均属于转化生长因子TGF-β超家族。BMP-2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMP之一。BMP-2具有诱导未分化的间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，并具有促进成骨细胞分化成熟功能，并参与骨和软骨的生长发育及重建过程。BMP-2蛋白质在细胞和动物体内的分布和定位，是目前在分子和细胞水平上研究BMP-2促进骨折愈合和骨组织修复的热点。

目前，在目标蛋白的定位技术方面的研究已经取得很多进展，不同的靶向蛋白的定位技术的原理也各不相同。目前用于BMP-2蛋白定位的方法主要有免疫荧光定位、构建融合蛋白载体和免疫胶体金标记法等。其中免疫荧光定位方法主要利用抗原与抗体相互结合的原理，该方法主要步骤为：首先将BMP-2抗体标记上特定的荧光素制成抗体标记物，然后利用该抗体标记物作为探针，将其与细胞或者动物体内的BMP-2抗原进行结合，利用荧光显微镜观察，其中荧光素受照射发出各种荧光，从而可以确定BMP-2蛋白的定位和性质。而构建融合蛋白载体主要步骤为：构建能表达含有绿色荧光蛋白和目的蛋白相互连接的融合蛋白的载体，并使其在动物或者细胞体内进行表达，通过在荧光显微镜下进行观察，进行靶蛋白的定位。免疫胶体金标记法中，当用金颗粒标记的抗体与抗原反应时，在光镜下呈现鲜艳的樱红色，从而获得抗原的定位信息。

在现有技术中，免疫荧光定位方法对仪器的要求比较高，并且结果不能长期保存。而对于现有技术中的构建融合蛋白载体方法，由于两个不同的基因相互连接，在翻译成蛋白的时候两个蛋白之间的空间构象极易发生改变而无法正确折叠，从而使荧光蛋白或者靶蛋白失去活性而无法达到定位或者对靶蛋白进行功能研究的目的。免疫胶体金标记法成本高，需要较大直径的金颗粒(40-50nm)才能获得较高的灵敏度，同时耗费抗体量较多，检测过程中需要较高浓度的标记物，并且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。因此需要开发一种简便快速成本低的BMP-2蛋白定位检测方法。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种含形态发生蛋白(BMP-2)和ZsGreen1基因的表达载体及其构建方法，旨在解决现有技术中BMP-2蛋白定位成本高效果不好的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种含BMP-2和ZsGreen1基因的表达载体构建方法，包括：

S01.通过PCR方法将BMP-2基因扩增，得扩增产物；

S02.将该扩增产物和pIRES2-ZsGreen1载体分别利用XhoI和BamHI酶进行双酶切处理，将所得含BMP-2基因的双酶切产物和含ZsGreen1基因的双酶切产物进行粘性末端连接，

其中所述通过PCR方法将BMP-2基因扩增时使用的引物对为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

本发明实施例还提供利用本发明的方法构建的含BMP-2和ZsGreen1基因的表达载体。

本发明实施例还提供本发明的含BMP-2和ZsGreen1基因的表达载体用于诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的应用，该应用包括将该表达载体转染至骨髓间充质干细胞的步骤。

本发明实施例采用了含有IRES序列的荧光报告载体，构建了能够同时表达非融合的BMP-2蛋白和ZsGreen1绿色荧光蛋白的荧光报告载体，该载体可同时表达上述两种蛋白，并且使得两种蛋白的空间构象和功能不会相互影响。因此通过该载体的表达可利用ZsGreen1绿色荧光蛋白对BMP-2蛋白表达和分泌进行亚细胞定位。该表达载体可以应用于动物体内的研究中，可利用该表达载体实时观察检测BMP-2在动物体内不同组织表达分布情况。该表达载体的构建，将更有利于探索BMP-2基因在骨折愈合、骨修复等方面的机制研究。

附图说明

图1是本发明实施例中使用的pIRES2-ZsGreen1载体的序列位点及双酶切位点示意图；

图2是本发明实施例2中将表达载体pIRES2-ZsGreen1-BMP-2转染至COS-1细胞系后的显微镜下观测图片；

图3是本发明实施例2中pIRES2-ZsGreen1-BMP-2转染细胞后经流式细胞仪检测的转染效率图；