[发明专利]一种生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生产荧光观赏鱼的方法，特别是涉及生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法。

背景技术

观赏鱼是一个有全球市场的鱼类产业，而荧光鱼由于可以获得区别于传统鱼的引人注目的色彩、尤其在光线较暗的情况下有奇特的装饰效果，因此极大的改变了观赏鱼市场的格局。目前利用转基因技术可以在短时间内获得具有特定性状的鱼，而不需要通过传统的杂交技术来缓慢改变鱼的特性。利用转基因技术获得荧光观赏鱼已经取得了巨大的商业价值。

现有技术中已存在多种将外源基因置入鱼中的技术，包括微注射、病毒介导的基因整合基因重组、基因敲除、以及转座子等技术。目前，已有一些利用转基因技术构建荧光观赏鱼的报道，如台湾邰港公司将荧光蛋白连接启动子转入鱼内基因组中，获得了多个观赏鱼种；新加坡国立大学将四种特异性的启动子连接单一荧光，在荧光鱼的特定部位表达荧光基团。美国Yorktown Technology公司也通过特异性启动子驱动蓝色蛋白在鱼体内的表达。

荧光观赏鱼的现有技术（例如CN1590548A、CN1647625A、US7135613、US8232450、US7700825等）均存在以下弊端。首先，现有的荧光观赏鱼构建技术中实现的均是荧光蛋白的组织特异性表达，即仅在鱼的特定组织出现荧光，由此构建的荧光鱼从视觉角度缺乏一定的观赏性。其次，实现的均是单色荧光的表达，不能在外界的刺激下改变颜色，由此获得的荧光观赏鱼缺乏一定的互动性或趣味性。此外，一些鱼体自身体表色素沉淀较多，导致鱼体表面透明度降低，这不但屏蔽了激发光对荧光基团的激发，导致荧光基团发光效率低，而且遮阻了荧光基团的发射光到达体外，从而进一步降低了观赏性。上述专利为了在一定程度上挽救这个缺点，不得不用很强的启动子来驱动荧光基团的表达，但代价却是荧光基团的光毒性造成鱼的健康受到影响，使得鱼的寿命大大缩短。

此外，现有技术中所获得的荧光鱼均未实现绝育化，这样的转基因鱼种一旦进入自然环境，可能对自然界物种造成不可预知的潜在危害。

发明内容

本发明的目的是要克服现有技术中的至少一个缺陷，提供一种生产荧光蛋白能够全身表达并且在光刺激下荧光颜色可变的观赏鱼的生产方法。在本发明中，将这种新的鱼种称为“可变色光诱导荧光观赏鱼”。

进一步地，本发明还提供了生产可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体的方法，生产可变色光诱导荧光观赏鱼的绝育体的方法以及针对体表色素较多的鱼种进行基因改造使其适于用来生产可变色光诱导荧光观赏鱼或使得所生产的可变色光诱导荧光观赏鱼能够更佳地全身表达可变色光诱导荧光。

本发明揭示的原理还可适用于其他水生生物（例如虾、水母等），构建全身发可变色光诱导荧光的其他观赏性水生生物。

本发明的生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法，包括以下步骤：

步骤A：构建可变色光诱导荧光蛋白的重组转座载体，其中所述可变色光诱导荧光蛋白选自PA-GFP、PA-RFP-1、PS-CFP2、Kaede、KiKGR、Monomeric Eos、Dendra-2、FP595、Dronpa、Padron及其衍生物，优选为Kaede；

步骤B：将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；

步骤C：筛选并鉴定出能够稳定表达可变色光诱导荧光蛋白的鱼种，以获得可变色光诱导荧光观赏鱼。

进一步地，所述重组转座载体中的启动子为能在鱼全发育期以及全身稳定驱动表达的启动子，优选为Ubiquitin启动子。

进一步地，所述重组转座载体为Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2载体，其序列结构如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，在所述步骤C之后还包括如下获得所述可变色光诱导荧光鱼的纯合体F3的步骤：

将所述步骤C中获得的所述可变色光诱导荧光观赏鱼与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F1，从所述杂合体F1中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体F1；

选取单只全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体F1与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F2，从所述杂合体F2中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的雌鱼和雄鱼；

将筛选出的所述雌鱼和所述雄鱼进行交配，得到所述可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体F3从所述纯合体F3中筛选出含有可变色光诱导荧光蛋白的纯合可变色光诱导荧光观赏鱼。