[发明专利]一种生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法

权利要求书

1.一种生产可变色光诱导荧光观赏鱼的方法，包括以下步骤：

步骤A：构建可变色光诱导荧光蛋白的重组转座载体，其中所述可变色光诱导荧光蛋白选自PA-GFP、PA-RFP-1、PS-CFP2、Kaede、KiKGR、Monomeric Eos、Dendra-2、FP595、Dronpa、Padron及其衍生物，优选为Kaede；

步骤B：将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；

步骤C：筛选并鉴定出能够稳定表达可变色光诱导荧光蛋白的鱼种，以获得可变色光诱导荧光观赏鱼。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组转座载体中的启动子为能在鱼全发育期以及全身稳定驱动表达的启动子，优选为Ubiquitin启动子。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组转座载体为Ubiquitin启动子-Kaede-mini Tol2载体，其序列结构如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求1所述的方法，在所述步骤C之后还包括如下获得所述可变色光诱导荧光鱼的纯合体F3的步骤：

将所述步骤C中获得的所述可变色光诱导荧光观赏鱼与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F1，从所述杂合体F1中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体F1；

选取单只全身表达可变色光诱导荧光蛋白的杂合体F1与野生型鱼杂交，产生所述可变色光诱导荧光观赏鱼的杂合体F2，从所述杂合体F2中筛选出全身表达可变色光诱导荧光蛋白的雌鱼和雄鱼；

将筛选出的所述雌鱼和所述雄鱼进行交配，得到所述可变色光诱导荧光观赏鱼的纯合体F3从所述纯合体F3中筛选出含有可变色光诱导荧光蛋白的纯合可变色光诱导荧光观赏鱼。

5.根据权利要求4所述的方法，还包括如下绝育步骤：

通过温度物理绝育处理法、静水压物理绝育处理法、电休克物理绝育处理法、细胞松弛素B化学绝育处理法、秋水仙素化学绝育处理法、聚乙二醇化学绝育处理法、或6-二甲基氨基嘌呤化学绝育处理法对所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵进行处理，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体；

将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的二倍体和所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的四倍体进行杂交，以获得所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的绝育的三倍体。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述温度物理绝育处理法包括：

将所述纯合可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵置于42℃的养鱼水中，热激10分钟。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括如下色素基因敲除步骤之一：

在所述步骤A之前，通过基因敲除技术对所述待处理鱼种进行处理，敲除其中的鱼体色素基因；或者

在获得所述可变色光诱导荧光观赏鱼之后，通过基因敲除技术对所述可变色光诱导荧光观赏鱼进行处理，敲除其中的鱼体色素基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，

所述待处理鱼种为斑马鱼，被敲除的所述鱼体色素基因是斑马鱼golden基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述色素基因敲除步骤包括：

在所述斑马鱼或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的golden基因组外显子区域中，寻找NGG的特征序列，其中紧邻NGG之前20bp序列即为候选的目标序列；

将所述目标序列构建入pT7gRNA载体；

将含有所述目标序列的pT7gRNA载体与Cas9mRNA共同注射入所述斑马鱼的单细胞期受精卵或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的单细胞期受精卵中，并将其培养成幼鱼；

根据所述幼鱼的鱼体颜色的深浅筛选出色素基因敲除成功的幼鱼作为之后繁殖的种鱼，以制备出敲除了鱼体色素基因的待处理鱼种或生产出敲除了鱼体色素基因的可变色光诱导荧光观赏鱼。