[发明专利]包含重组组织型纤溶酶原激活剂的药物组合物

说明书

技术领域

本发明涉及分子医学领域，更具体地，本发明涉及一种重组长效组织型纤溶酶原激活剂突变体TNK-tPA的Fc融合蛋白，另一方面涉及所述融合蛋白的制备工艺及其在医疗上的应用，特别是在治疗急性心肌梗塞、急性肺栓塞、急性缺血性脑卒中等多种与需要血栓快速溶解相关的疾病以及它在与人类血液或组织接触的医疗器械或生物医学材料表面的涂层药物方面的新用途。

背景技术

组织型纤溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator,tPA)是纤溶酶原激活剂的一种，主要由血管内皮细胞合成和释放，它是一种丝氨酸蛋白酶，主要存在于哺乳动物血浆中。tPA高效特异的与血栓中的纤维蛋白结合，所产生的tPA-纤维蛋白复合物能快速高效地激活血凝块中的纤溶酶原，产生纤溶酶，使纤维蛋白降解成可溶性产物，达到血栓溶解且栓塞的血管重新畅通的目的。tPA于1987年由美国FDA批准作为治疗急性心肌梗塞的基因工程药物投放市场，1990年FDA批准其用于治疗急性肺栓塞。1996年，再被批准用于急性缺血性脑卒中，tPA是目前治疗卒中的唯一急救药物。

成熟的tPA分子是含527个氨基酸的单链糖蛋白，分子量67～72KD，包含17对二硫键。在溶纤过程中，tPA分子在Arg275-Ile276位点被蛋白酶切割，形成活性更高的双链分子，N端275个氨基酸残基形成重链，C端252个氨基酸形成轻链，轻、重链之间由一个二硫键相连。重链含4个结构域，分别为指区(Finger，F)、生长因子区(EGF)、主区1(Kringle1，K1)、主区2(Kringle2，K2)；F区位于4-50位氨基酸序列，含纤维蛋白结合位点(高亲和力结合功能域)；EGF区位于51-87位氨基酸序列，含细胞膜受体结合位点，该区介导t-PA与肝细胞和血管内皮细胞结合，对半衰期有重要影响；K1区位于87-176位氨基酸序列，为受体结合部位或与纤维蛋白低亲和结合有关的结构；K2区位于176-262位氨基酸序列，其与K1区功能相似，含纤维蛋白结合位点；轻链含丝氨酸蛋白酶结构域(serine protease，Ser Pr区)，由His322、Asp371和Ser478组成活性中心，催化纤溶酶原转化成纤溶酶。

tPA最大特点是与纤维蛋白特异的高亲和力结合，与纤维蛋白结合的tPA其激活纤溶酶原的能力比游离状态的tPA高100倍。因正常人血液中极少有纤维蛋白生成，tPA不会使正常人发生系统性纤溶状态。正是由于tPA的高效、特异溶栓作用，是早期利用基因工程技术开发的首批生物药之一，也是到目前为止治疗栓塞性疾病的理想药物。但tPA用于溶纤治疗也有一定的局限性。一方面它进入血液后能与纤溶酶原激活剂抑制剂(Plasminogen activator inhibitor，PAI)形成复合物，导致其迅速失去活性；另一方面存在于肝细胞膜上的tPA特异性受体可快速与tPA结合，致使tPA在血液中的半衰期很短，仅为4～6分钟。因此，tPA的治疗剂量高达100～150mg，这样就增加了由系统性纤溶引起出血的风险。

近年来，研究人员从tPA的结构入手，以构效关系为原则，利用DNA重组及蛋白质工程技术构建了一系列tPA变异体，如瑞替普酶(reteplase)、孟替普酶(monteplase)、兰替普酶(1anoteplase)、帕米普酶(pamiteplase)等，它们在延长其体内半衰期、增加与纤维蛋白的结合亲和力及提高对纤溶酶原的催化活性等方面均有较大改善，较之天然tPA有更广阔的应用前景。其中，TNK-tPA(TNKase)是由美国基因泰克公司研制开发的tPA多点突变体，于2000年被美国FDA批准用于治疗急性心肌梗塞。此突变体综合了提高tPA与血纤维蛋白结合专一性和降低对PAI-1结合敏感性的KHRR296-299AAAA突变(K)，降低体内清除速率、延长半衰期的Thr103Asn突变(T)和缺乏高甘露糖侧链的Asn117G1n突变(N)(Keyt B A，Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：3670-3674)。TNK-tPA具有许多优良特性如半衰期延长(约15～19分钟)，仅需单次弹丸式静脉注射给药，与纤维蛋白特异性结合增加14倍；与PAI-1特异性结合降低80倍，几乎不影响机体凝血系统，内在致血栓作用小于其他纤溶酶原激活剂等(Cohen M，Am J Emerg Med，2004，22：14-23)。这决定了其血管再通更迅速、更持久，血栓溶解作用更强、更完全，对富含血小板的血栓作用更明显。