[发明专利]一株生防枯草芽胞杆菌杆菌霉素L分离纯化方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一株生防枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916的胞外脂肽抗生素杆菌霉素L的分离纯化方法。

背景技术

枯草芽胞杆菌是植物和土壤生态中的优势生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。由于枯草芽胞杆菌胞外能产生丰富的抗菌代谢产物，同时由于其具有生长速度快，存活时间长，对酸、碱、高温、紫外线以及电磁辐射等不良环境的耐受能力强，营养要求简单，安全无毒等优点，因此被广泛的应用于植物真菌病害和细菌病害的防治。

枯草芽胞杆菌分泌的抗菌代谢产物主要有三大类，其一是通过核糖体合成途径合成的多肽类小分子化合物；其二是通过非核糖体合成途径的合成的脂肽类抗生素；其三是合成的一些非蛋白质性质的杂合抗生素。

脂肽类抗生素是一类由亲水性环状短肽头部和长链疏水性脂肪酸尾部组成的双亲性次生代谢产物，具有抗菌活性和溶血性能，在医药、农药和工业上具有广泛的应用价值。脂肽类抗生素根据其化学结构的差异可分为表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和泛革素(Fengycin)三大家簇。

表面活性素家簇结构特点是由7个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有13～15个碳原子β-羟基脂肪酸交联形成内酯环状结构的极性化合物。表面活性素表现出较强溶血活性、抑制细菌和病毒的活性。伊枯草素家簇结构特点是由7个氨基酸残基的多肽链与含有14～17β-氨基脂肪酸链相连形成的化合物。伊枯草素也具有较强的溶血活性和强的抗真菌活性。泛革素家簇结构的特点是由10个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有14～18个β-羟基饱和或非饱和的脂肪酸交联形成内酯环。泛革素的溶血作用没有表面活性素和伊枯草素强烈，但表现出强烈的抗真菌活性和弱的抗细菌和病毒活性。

脂肽抗生素的理化性质稳定，如：热稳定好，在121℃高压灭菌30min，活性还能保持在95％；对胰蛋白酶、蛋白酶K等多种蛋白酶不敏感；对氯仿等有机溶剂具有耐受性；抗紫外照射。脂肽抗生素具有如此高的稳定性，与其分子量小和特殊的环状结构有关。

目前通过构建产脂肽抗生素缺失突变株及突变株抗菌性能的研究表明脂肽抗生素是枯草芽胞杆菌拮抗病原真菌的主要因子。一株具有优良拮抗性能的枯草芽胞杆菌菌株通常能同时合成分泌表面活性素、伊枯草素和泛革素；其中任一一种脂肽类抗生素合成能力的缺失都会导致突变株抗真菌活性不同程度的下降；当其中两种或者三种脂肽类抗生素合成能力的全部缺失，会极大的降低或者导致突变株完全丧失抗真菌活性。表面活性素、伊枯草素和泛革素对植物病原真菌具有协同增效作用。

杆菌霉素L是脂肽类抗生素伊枯草素家族的一种，通过构建杆菌霉素L合成能力丧失突变株，及对杆菌霉素L的生物学功能研究表明杆菌霉素L不仅是生防枯草芽胞杆菌抗真菌的关键因子之一，杆菌霉素L基因簇的突变还能影响枯草芽胞杆菌生物膜的形成，感受态的形成及定殖能力等生命现象。杆菌霉素L在医药、工业和农业上作为抗真菌制剂在具有潜在的应用前景，因此建立一种高效的分离方法纯化杆菌霉素L的方法具有重要的价值。

通常筛选到的一株高产杆菌霉素L的枯草芽胞杆菌菌株，其还能分泌泛革素和表面活性素，由于这三类脂肽类化合物的理化性质相近，因此不容易通过简单的纯化方法将它们分开，特别是将杆菌霉素L和泛革素。

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916是江苏省农业科学院20世纪90年代分离的生防菌，对水稻纹枯病具有很好的防治效果，已经成功进入商业化生产10多年，产生了巨大的经济效益。该菌株于2002年09月30日在中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.0808。经过前期研究表明Bs916能分泌产生杆菌霉素L、泛革素和表面活性素三类脂肽抗生素，是Bs916具有抗真菌活性的关键因素。本发明通过构建基因突变株和色谱分离技术相结合建立一种从Bs916中分离纯化杆菌霉素L的新方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供枯草芽胞杆菌抗菌脂肽杆菌霉素L，以及一种枯草芽胞杆菌胞外抗菌脂肽杆菌霉素L的分离纯化方法。

本发明的目的是这样实现的：枯草芽胞杆菌抗菌脂肽杆菌霉素L，其特征在于：从枯草芽胞杆菌Bs916的泛革素基因突变株BFM的胞外产物中分离纯化后获得；通过电喷雾四级杆飞行时间串联质谱测定包含有分子量为1020.6、和1034.6等相差一个亚甲基(-CH₂)的杆菌霉素L同系物。

一种枯草芽胞杆菌胞外抗菌脂肽的分离纯化方法，其特征在于：