[发明专利]一株生防枯草芽胞杆菌杆菌霉素L分离纯化方法

权利要求书

1.一株枯草芽胞杆菌胞外脂肽抗生素杆菌霉素L，其特征在于：从枯草芽胞杆菌胞外产物中分离纯化后获得；通过电喷雾四级杆飞行时间串联质谱测定，分子量为1021.5、1035.5和1049.5等相差一个亚甲基(-CH₂)的杆菌霉素L同系物。

2.一种如权利要求1所述的一株枯草芽胞杆菌胞外杆菌霉素L的分离纯化方法，其特征在于：

a、从保藏号为CGMCC No.0808的枯草芽胞杆菌B.subtilis916中构建脂肽抗生素泛革素合成缺失的突变株BFM；

b、从双突变株BFM的发酵液中采用酸沉淀甲醇抽提分离表面活性素的粗提物；

c、将粗提物采用去离子水稀释为含30％甲醇水溶液，pH值调至7.0，然后上样于NH₂固相萃取柱，分别用含50％甲醇水溶液，100％甲醇，含0.5％甲酸甲醇溶液，1％甲酸甲醇溶液，2％甲酸甲醇溶液梯度洗脱，在紫外光210nm处检测，其中在含1％甲酸甲醇洗脱溶液中检测到杆菌霉素L；

d、将含1％甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩、再用去离子水稀释为30％甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱；采用梯度洗脱30％，50％，70％，90％甲醇水溶液洗脱，在紫外波长210nm处检测，其中在含70％甲醇水洗脱溶液中检测到杆菌霉素L；

e、将70％甲醇水洗脱溶液氮气吹干后再用去离子水稀释为40％甲醇水溶液，再上样于C18固相萃取柱；采用10倍柱体积的50％，55％，60％，65％，70％，75％甲醇水溶液梯度洗脱，其中在60％、65％洗脱液得到目标化合物表面活性素，合并60％、65％洗脱液氮气吹干浓缩后真空干燥，得到杆菌霉素L的纯品；

f、提取的杆菌霉素L采用Tricine-SDS-PAGE检测，已经达到电泳纯，即只有一条带。提取的杆菌霉素L高效液相色谱的检测条件为：采用C18(5μm；250by4.6mm；VYDAC218TP；VYDAC，Hesperia，CA)柱；流动相为乙腈：水：三氟乙酸(40：60：0.5vol／vol)；流速为1mL·min^-1；紫外检测波长为210nm；已经达到色谱纯。

3.根据权利要求2所述的一种枯草芽胞杆菌胞外杆菌霉素L的分离纯化方法，其特征在于：从保藏号为CGMCC No.0808的双突变株BFM中分离脂肽粗提物是：将突变株BFM转接到LB培养液中，在28℃、180r／min条件下振荡培养72h，发酵液离心除去菌体，用浓盐酸调至pH2.0沉淀过夜，8000g离心25min得到沉淀，沉淀采用甲醇抽提，抽提物经0.22μmol·L^-1微孔滤膜后，即为粗制备的杆菌霉素L样品。