[发明专利]一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽用疫苗技术领域，具体涉及一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

禽流感(Avian Influenza)是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为Ⅰ类传染病。根据其血凝素HA和神经氨酸酶NA的抗原性将禽流感病毒分成不同亚型，包括17种特异的HA亚型和9种特异的NA亚型，两者的不同组合形成不同亚型禽流感病毒。根据毒株致病性的不同，禽流感可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感两大类。H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，产蛋家禽感染后,可引起产蛋率下降，软壳蛋、无壳蛋增多，严重的将会停止产蛋。种禽感染后，除上述症状外，还表现出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雏禽出壳困难，出壳后的雏禽弱雏增多。雏禽在一周内死亡率较高，且易感染大肠杆菌，治疗较困难。H9亚型禽流感混合感染其他病原时，可导致发病率和死亡率的大幅度提高，给养殖业带来巨大损失。近年来，H9亚型禽流感病毒感染人的病例也时有发生，因此它也是不容忽视的人兽共患病病原。

疫苗接种是预防和控制流感病毒流行的最有效手段，但由于甲型流感病毒的HA和NA具有高度的变异性，只有当疫苗株和流行株匹配时，疫苗才能起到有效的保护作用。目前，控制禽流感病毒发病的主要手段是接种灭活全病毒疫苗，其生产依靠鸡胚法实现，生产成本高，并且具有生物安全隐患；灭活疫苗多为油包水型，注射时阻力大，不易吸收，抗体产生慢。因此有必要开发一种依赖于细胞系，剂型更合理，更易吸收，同时具有更好的免疫应答效应的疫苗产品。

发明内容

为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗及其制备方法。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗及其制备方法，包括以下步骤：

1）制苗用细胞的培养：取细胞培养瓶中生长良好的MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5×10⁵/mL-5×10⁶/mL的细胞密度接种于含有8%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃条件下摇瓶培养过夜；

2）细胞的培养与收获：当细胞长满培养基单层时，按种毒接种量为0.01-0.5MOI接种病毒含量≥10^6.5TCID₅₀/mL的HP株H9亚型禽流感病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养48-96小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

3）病毒的灭活：将步骤2）得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.5-2‰(v/v)，充分摇匀毒液，以180r/min转速，室温条件下（20-25℃）灭活12-48小时；

4）疫苗的制备：将灭活的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，将滤过液用截留分子量为300KD的Millipore膜包进行2～3倍浓缩，浓缩后的病毒液即为水相，使用前置于28～32℃水浴锅中进行预热；取法国赛比克公司的MONTANIDE^TMISA206VG型佐剂，充分混匀后置于28-32℃水浴锅中预热至水浴锅温度，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1：0.8-1：1.2（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1-2h，然后采用ATS工业系统有限公司的AH100D型均质机调整二级阀压力为20-30bar、一级阀压力为400-500bar对该混合物乳化2-3次，即得到一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗。

上述方法中，步骤1）所述的细胞接种量优选为8×10⁵/mL；步骤2）所述的病毒接种量优选为0.1MOI；步骤3）所述的甲醛终浓度优选为1‰；步骤3）所述的灭活温度为20℃，灭活时间为20h；步骤4）所述的水相预热温度优选为31℃；步骤4）所述的油相预热温度优选为31℃；步骤4）所述的水相与油相比例优选为1:1；步骤4）所述的均质机参数优选为二级阀压力25bar、一级阀压力400bar；步骤4）所述的乳化次数优选为3次。

附图说明

图1为疫苗接种后产生抗体水平对比图

具体实施方式

实施例1

1.1病毒的培养、收获