[发明专利]一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制苗用细胞的培养：取细胞培养瓶中生长良好的MDCK细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备细胞悬液，细胞计数后按5×10⁵/mL-5×10⁶/mL的细胞密度接种于含有8%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃条件下摇瓶培养过夜；

2）细胞的培养与收获：当细胞长满培养基单层时，按种毒接种量0.01-0.5MOI、病毒含量大于等于10^6.5TCID₅₀/mL的禽流感病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养48-96小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

3）病毒的灭活：将步骤2）得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.5-2‰(v/v)，充分摇匀毒液，以180r/min转速，20-25℃条件下灭活12-48小时；

4）疫苗的制备：将灭活后的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，将滤过液用截留分子量为300KD的膜包进行2-3倍浓缩，浓缩后的病毒液即为水相，使用前置于28-32℃水浴锅中进行预热；取疫苗佐剂，充分混匀后置于28-32℃水浴锅中预热至水浴锅温度，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1:0.8-1:1.2（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1-2h，然后采用均质机调整二级阀压力为20-30bar、一级阀压力为400-500bar对该混合物乳化2-3次，即得到一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗及其制备方法，其特征在于步骤1）所述的EDTA-胰酶细胞分散液配方为：含0.25%（w/v）胰酶、0.02%(w/v)EDTA的Hank’s液。

3.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1）所述的细胞接种量为8×10⁵/mL。

4.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤2）所述的病毒接种量为0.1MOI。

5.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤2）所述的培养时间为72h。

6.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的甲醛终浓度为1‰。

7.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的灭活条件为20℃、20小时。

8.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4）所述预热后的水相和油相以相同温度混合。

9.根据权利要求8所述的一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于所述相同温度为31℃。

10.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4）所述的均质机参数为二级阀压力为25bar、一级阀压力为400bar。