[发明专利]一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料功能化及应用领域，涉及一种在纳米材料表面进行的滚环扩增信号放大技术，构建的生物复合结构可用于抗肿瘤新型药物载体的开发及研究。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重要疾病之一，在许多国家，恶性肿瘤的死亡率位居前列。近年来快速发展的纳米生物技术，为解决生物医学领域的重大问题提供了强有力的手段，并形成纳米生物医学这以新型的研究领域。纳米材料作为新一代的药物载体的研究正蓬勃发展，它本身能改善药物的水溶性、提高药物的稳定性以及实现药物缓慢控制释放、靶向定位、以及多靶向治疗等。新型的纳米材料以及结构的制备与应用不仅给纳米技术注入了新的活力，也给抗肿瘤药物的研究及发展起了巨大的推动作用。目前利用纳米颗粒或纳米结构作为抗肿瘤药物载体进行抗肿瘤的研究中，使用较多的如高分子纳米材料、脂质体以及金属纳米粒子等，并且已有很多纳米药物运载系统成功应用的先例，但不可否认的是，在药物的高效负载、靶向输运、集治疗和检测于一体的多功能药物载体的研究方面仍然存在诸多问题，比如脂质体的粒径分布可能影响载体进入细胞的效率，另外一些金属纳米粒子存在生物安全方面的争议等。因此，近几年国际上基于DNA分子进行设计的纳米生物复合结构，成为新一代的抗肿瘤药物载体的相关研究备受瞩目。

滚环扩增技术是模仿生物体内复制的一种信号放大机制：它以DNA寡核苷酸为引物，以单链环状DNA为模板，在DNA聚合酶（phi29 polymerase）的作用下实现DNA在体外的线性或指数型扩增，并生成包含若干重复序列（10³～10¹⁰）的DNA长链，其对DNA的检测灵敏度最高可达10个拷贝数。因其温和的扩增条件和高效扩增的特点将与荧光、电化学、电化学发光等生物检测技术联用可以实现高灵敏的生物分子检测。滚环扩增技术在DNA、痕量蛋白、及生物小分子等生物分子诊断领域具有潜在的应用价值。滚环扩增技术可将纳米材料表面的的DNA高效延伸，从而为药物的高效负载提供可能。在充分利用和发展纳米技术特有的优势的基础上，有望基于DNA纳米结构制备高效、靶向、低毒及多功能的纳米生物复合结构作为抗肿瘤药物载体从而促使药物发挥更为高效作用，为抗肿瘤研究工作累积理论基础和实践经验。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法。

一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，将扩增引物DNA组装在纳米材料的表面，加入环状DNA扩增模板以及其他扩增混合物后进行滚环扩增，所制备的产物为纳米金表面延伸而得到的长单链DNA从而用作新型抗肿瘤药物载体。

所述的纳米材料为有着较好生物相容性的纳米材料，具体为纳米球、纳米管、纳米棒、脂质体中的一种或其组合。

所述的引物DNA为5^，端经过修饰的单链DNA，具体为巯基修饰、或生物素修饰、或氨基修饰。

所述的环状DNA，制备过程如下：

（1）碱基数为60-210个碱基的长单链预成环DNA，5^，端修饰，与其在两端互补的一段靶序列DNA混合；

（2）高温处理后，缓慢降至室温，退火；

（3）加入连接酶进行连接；

（4）连接酶高温变性；

（5）加入聚合酶，将靶序列从闭合环DNA上剪切；

（6）聚合酶高温变性；

（7）使用超滤管，离心法去除混合溶液中变性的酶.

步骤（1）所述预成环DNA为5^，端磷酸基团修饰；步骤（2）所述为90℃高温变性1分钟；步骤（3）所述连接酶可生成磷酸二酯键，可为T4 DNA连接酶，或E.coliDNA连接酶，连接条件为25℃, 16小时；步骤（4）所述连接酶在65℃，10分钟变性处理；步骤（5）所述为加入具有3^，—5^，外切核酸酶活性的T4 DNA聚合酶，剪切条件为37℃水浴中24小时；步骤（6）所述为聚合酶在85℃，10分钟变性处理；步骤（7）所述超滤管规格为30KDa，离心条件为4℃，10000rpm/min，5分钟。

所述的滚环扩增过程，具体为：

（1）滚环扩增混合物，混合均匀；

（2）置于水浴中扩增；

（3）phi29聚合酶变性；

（4）离心洗涤去除未反应物。