[发明专利]一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法

权利要求书

1.一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，将扩增引物DNA组装在纳米材料的表面，加入环状DNA扩增模板以及其他扩增混合物后进行滚环扩增，所制备的产物为纳米金表面延伸而得到的长单链DNA从而用作新型抗肿瘤药物载体。

2.根据权利要求1所述一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，所述的纳米材料为有着较好生物相容性的纳米材料，具体为纳米球、纳米管、纳米棒、脂质体中的一种或其组合。

3.根据权利要求1所述一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，所述的引物DNA为5^，端经过修饰的单链DNA，具体为巯基修饰、或生物素修饰、或氨基修饰。

4.根据权利要求1所述一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，所述的环状DNA，制备过程如下：

（1）碱基数为60-210个碱基的长单链预成环DNA，5^，端修饰，与其在两端互补的一段靶序列DNA混合；

（2）高温处理后，缓慢降至室温，退火；

（3）加入连接酶进行连接；

（4）连接酶高温变性；

（5）加入聚合酶，将靶序列从闭合环DNA上剪切；

（6）聚合酶高温变性；

（7）使用超滤管，离心法去除混合溶液中变性的酶。

5.根据权利要求4所述一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤（1）所述预成环DNA为5^，端磷酸基团修饰；步骤（2）所述为90℃高温变性1分钟；步骤（3）所述连接酶可生成磷酸二酯键，可为T4 DNA连接酶，或E.coliDNA连接酶，连接条件为25℃, 16小时；步骤（4）所述连接酶在65℃，10分钟变性处理；步骤（5）所述为加入具有3^，—5^，外切核酸酶活性的T4 DNA聚合酶，剪切条件为37℃水浴中24小时；步骤（6）所述为聚合酶在85℃，10分钟变性处理；步骤（7）所述超滤管规格为30KDa，离心条件为4℃，10000rpm/min，5分钟。

6.根据权利要求1所述一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，所述的滚环扩增过程，具体为：

（1）滚环扩增混合物，混合均匀；

（2）置于水浴中扩增；

（3）phi29聚合酶变性；

（4）离心洗涤去除未反应物。

7.根据权利要求1所述一种利用滚环扩增技术制备抗肿瘤药物载体的方法，其特征在于，步骤（1）所述的扩增混合物为金-引物DNA、环DNA、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP），或标记的脱氧核糖核苷三磷酸，如生物素（biotin）dNTP、异硫氰酸荧光素(FITC)-dNTP、花青类染料(Cy3、Cy5)-dNTP、放射性标记-dNTP，phi29聚合酶（10U/??L，终浓度为1U/??L）、及10×phi29扩增缓冲液，扩增缓冲液终浓度为1×；步骤（2）所述扩增条件是30℃水浴， 30-120分钟；步骤（3）所述phi29聚合酶变性条件是85℃，10-30分钟；步骤（4）所述离心条件为4℃，5000rpm/min，5-10 分钟。