[发明专利]一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种川贝母的生物技术方法，特别是涉及一种有效提高川贝母细胞同步化的诱导方法。

背景技术

川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科多年生草本植物，以鳞茎入药，为名贵的川产道地药材，堪称药中之宝。川贝母植株对生长环境要求苛刻，它喜冷阴气候条件，具有耐寒、喜湿、喜荫蔽、怕高温的特性。气温达到30℃或地温超过25℃，植株就会枯萎，在海拔低、气温高的地区不能生存，所以川贝母在海拔3500m～4500m的高度才能正常生长，这就使得川贝母野生资源十分稀缺，不能满足市场的需要。

多倍体药用植物一般具有根、茎、叶和花果的巨型性，抗逆性强，药用成分含量高等特性，这正是川贝母药材优质、高产育种所期望达到的目标。然而目前在植物多倍体的诱导过程中，常使用秋水仙素等药物来诱导植物染色体加倍，但这些药物都是采取阻断处于分裂时期细胞的纺锤丝的形成，从而获得多倍体细胞。众所周知，细胞在进行有丝分裂，细胞在间期的时间大大的长于分裂期；因此，采用秋水仙素等药物来诱导植物组织和器官产生多倍体时，都只能对分裂期的细胞有效，所以最终多倍体纯合体的诱导率都比较低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，该方法步骤简单，工艺稳定，适用于在工业化大生产中的广泛应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤：

S1：将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5～2cm²的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基中进行培养，pH值为5.6～6.5，培养条件：温度20～25℃，每天光照8～12h，光照强度为1000～1800lx；

S2：将S1步骤获得的疏松愈伤组织按5～20g·L^-1的接种量接入MS+KT 0.5～1.0mg·L^-1+2，4-D 0.5～2.0mg·L^-1+蔗糖10～25g·L^-1的液体培养基中进行悬浮培养，pH值为5.5～6.0，培养条件：温度18～22℃，每天光照6～10h，光照强度为600～1000lx，摇床转速为80～100r/min的条件下，进行20～30天继代培养一次；

S3：在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加1～3mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞10～18h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养1周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为50～80磅/英寸²，在20～25℃的培养条件下培养12～24h后放出氦气；

S4：将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.1～0.5mg·L^-1+KT 0.1～0.5mg·L^-1+蔗糖20～40g·L^-1+甘油5～20%的液体培养基中，在1～5℃的低温条件下培养12～24h后再放在温度为18～22℃条件下恢复培养24～48h。

优选地，S1步骤所述的培养基为：MS+6-BA 0.1～0.5mg·L^-1+NAA 0.1～1.0mg·L^-1+2，4-D 1.0～4.0mg·L^-1+蔗糖30～50g·L^-1+琼脂4.5～6.0g·L^-1。

优选地，S1步骤中培养条件：温度20℃，每天光照12h，光照强度为1600lx。

优选地，S2步骤中培养条件：温度20℃，每天光照8h，光照强度为800lx。

优选地，S3步骤中向培养基中通入氦气并保持压力为60磅/英寸²，在22℃的培养条件下培养20h后放出氦气。

优选地，S4步骤中培养条件：在3℃的低温条件下培养20h后再放在温度为20℃条件下恢复培养48h。

优选地，在经过S4步骤处理后，取少量细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴1滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。