[发明专利]胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学领域，具体为胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA诊断试剂盒及相关特异性抗原多肽的制备方法。 

背景技术

胸腺嘧啶核苷激酶(Thymidine kinase，TK)于1960年前后被发现，参与胸腺嘧啶核苷(简称为胸苷)合成代谢，是一种DNA合成的关键酶。随后的研究发现，TK拥有两种同工酶，其一为细胞质TK(cytosolic TK1)和线粒体TK(mitochondrial TK2)。而其中TK1与细胞分裂密切相关，在细胞分裂G1期含量比较低，而到S期后逐渐升高，至G2期达到最高。因此编码TK1的mRNA及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。 

1990年，JF Robertson等人通过比较早期乳腺癌患者，正常以及炎症对照组等的血清TK1蛋白表达量发现TK1在早期乳腺癌患者的血清含量显著提高，而炎症与正常对照组没有明显差异。血清TK1含量的多寡被认为能够反应乳腺癌病理进程(stage of disease in breast cancer)，因而他提出TK1可以做为一个乳腺癌早期诊断依据。同时1993年WG Cance，RJ Craven等人发现，TK1在一些乳腺癌细胞系，如BT20，SK-BR-3，MCF7细胞中过量表达。随后亦有多篇文献研究发现TK1激酶在肿瘤，特别是乳腺肿瘤患者的血清中表达升高，并认可TK1是一个潜在的乳腺癌诊断分子。如2005年Q HE等人发现血清TK1含量可以做为早期乳腺癌患者手术后，肿瘤复发几率的参考指标。 

乳腺癌患者中血清中，胸腺嘧啶核苷激酶蛋白量及酶活性显著增强，并随着肿瘤恶化程度提高而进一步升高。因此胸腺激酶被认为是一新型的肿瘤诊断标志物(Potential Cancer Marker)，分析其蛋白以及活性的数据变化能够为乳腺癌早期诊断提供有力依据。 

1)正常人血清样本中检出TK1表达异常，提示存在乳腺癌潜在性； 

2)良性乳腺肿瘤患者若检出TK1表达异常，提示有恶变的可能； 

3)乳腺癌肿瘤TK1表达高低，能够显示出其恶化程度。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA诊断试剂盒及相关特异性抗原多肽的制备方法，该诊断试剂盒可用于重组抗原的表达、医学临床乳腺癌患者的诊断，特别是体外乳腺癌诊断分子诊断试剂的开发。 

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 

胸腺嘧啶核苷激酶的ELISA诊断试剂盒，试剂盒内设有样品检测液、阴性对照和阳性对照；所述样品检测液为特异性抗原多肽。 

进一步，所述特异性抗原多肽的制备方法，包括以下步骤： 

(1)抗原片段的获得：利用生物信息学方法，在开始的生物信息资源数据库上收集胸腺嘧啶核苷激酶家族同源蛋白质序列，运用多序列比对程序clustalw进行多序列比对分析，胸腺嘧啶核苷激酶多种同源蛋白，寻找胸腺嘧啶核苷激酶最特异性的片段，随后进行抗原表位分析，寻找到了优势特异性TK1的蛋白表达区段Metl-Gln205，并进一步做原核载体的构建与表达纯化； 

(2)抗原蛋白的获得：从TK1编码基因调取相对应的基因核酸片段，总长度为702bp，并利用其进行亚克隆构建到原核表达重组质粒pGEX-4T-2中，通过调整诱导表达条件，诱导表达后可以收集菌体，并通过蛋白质纯化，得到高纯度的重组蛋白质，此蛋白质为N端谷胱转移酶融合蛋白，其重组蛋白通过SDS-PAGE鉴定纯度； 

(3)特异性抗体制备：将原核表达纯化得到的纯度在95％以上的重组蛋白除去内毒素，再进行动物免疫，通过三次腹腔注射重组蛋白使小鼠对其产生免疫反应，取小鼠腹水纯化得到抗血清，经过进一步的纯化与分离得到多克隆抗体，将TK1(1-205)特异性抗原免疫小鼠后，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经多次筛选获得阳性的单克隆细胞株，并进行腹水生产和单克隆抗体制备； 

(4)效价和特异性的评价：采用ELISA技术和Western blot技术对制备的单克隆抗体和多克隆抗体进行效价以及特异性的评价； 

(5)包装：运用TK1的ELISA试剂盒将获得的特异性抗原多肽按照标准包装形式统一规。 

综上所述，本发明有益效果： 

本发明可用于重组抗原的表达、医乳腺癌以及其它一些恶性肿瘤诊断，特别是体外乳腺癌早期诊断试剂的开发，它不与乳腺癌诊断之外的其它肿瘤反应，使用更方便，成本更低。 

具体实施方式