[发明专利]一种内皮克隆形成细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及内皮克隆形成细胞的分离方法。

背景技术

内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，在维持血管内皮环境稳定中扮演着重要的角色。根据内皮祖细胞（EPCs）克隆形态、出现时间先后和细胞增殖潜力，体外培养的外周血MNCs可分化出早期和晚期EPCs。内皮克隆形成细胞是近年来发现的一种晚期EPCs亚群，因具有更强的增殖能力及血管形成能力，是理想的移植种子细胞。内皮克隆形成细胞可以从骨髓、脐带血、外周血、脐带等多种组织当中分离获得。

脐带静脉含有大量的内皮克隆形成细胞，取材容易，操作简单，是分离内皮克隆形成细胞的良好来源。目前，通常采取酶消化法或机械刮取法，从脐带静脉上获取内皮克隆细胞，接种到适合的培养基中培养。但是，采用机械刮取的方法，内皮克隆形成细胞与胶原组织不能成功分离，分离效率低，而酶消化法的分离也往往不够彻底，分离效率低。

建立一种高效的内皮克隆形成细胞分离培养方法，对临床大规模应用有重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的内皮克隆形成细胞的分离方法。

本发明内皮克隆形成细胞的分离方法，包括如下步骤：

（1）酶消化：取脐带静脉，用碱性或中性缓冲液灌注冲洗至流出的液体透明，灌入胶原酶或者胶原酶与胰酶的混合酶，封闭两端，消化15～60min，打开两端，收集消化液；

（2）机械刮取：将脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮刮取脐带静脉内表面3～10分钟，再用碱性或中性缓冲液洗涤，收集洗涤液；

（3）将步骤（1）的消化液和步骤（2）的洗涤液合并，离心，去上清，即可。

步骤（1）中，所述碱性或中性缓冲液是PBS缓冲液、DPBS缓冲液或者Hanks缓冲液。

步骤（1）中，所述胶原酶是II型胶原酶。

步骤（1）中，所述胶原酶的浓度为0.2%，所述胰酶的浓度为0.5%，胶原酶与胰酶的体积比为1:1。

步骤（1）中，所述消化的温度为37℃。

步骤（1）中，所述消化的时间是15～30min。

步骤（2）中，所述刮取的时间是5分钟。

步骤（2）中，所述碱性或中性缓冲液是PBS缓冲液、DPBS缓冲液或者Hanks缓冲液。

步骤（2）中，所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的0.5～1.5倍（ml/cm）。优选地，所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的1倍（ml/cm）。

本发明内皮克隆形成细胞的分离方法，通过酶消化工艺和机械刮取工艺的特定组合，有效地将内皮克隆形成细胞从脐带静脉组织中分离，获得的细胞数量多，分离效率高，临床应用前景优良。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明：

图1为P0代细胞形态特征；

图2为内皮克隆形成细胞细胞表面标志检测；

图3为内皮克隆形成细胞的LDL内吞实验，图中的光信号为内皮克隆形成细胞内吞后的LDL在激光的激发下发出的阳性信号；

图4为内皮克隆形成细胞的体外血管形成实验。

具体实施方式：

实施例1 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法

脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，采集后放于含双抗的PBS溶液中4℃保存，48h内处理。反复清洗，并用磷酸缓冲液PBS灌注冲洗脐带静脉，直至流出液体透明。

用止血钳夹住脐带一端，用移液枪将II型胶原酶（浓度0.2%）加入并充满脐带静脉，用止血钳夹住脐带另一端；37℃摇床消化30分钟；消化完成后，取下止血钳，收集消化液到50ml离心管中；将脐带沿脐带静脉剖开，暴露出脐带静脉内表面，用细胞刮轻刮脐带静脉5分钟；用PBS溶液清洗，所述缓冲液的用量为脐带静脉长度的1倍（ml/cm），收集洗涤液与离心管中。

将收集细胞的离心管在4℃、500g的条件下，离心5分钟，即可。

实施例2 本发明内皮克隆形成细胞的分离方法

脐带取自足月顺产或剖腹产的健康产妇，采集后放于含双抗的DPBS缓冲液中4℃保存，48h内处理。反复清洗，并用磷酸缓冲液PBS灌注冲洗脐带静脉，直至流出液体透明。