[发明专利]一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织与细胞工程领域，尤其提供了一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法。

背景技术

乳腺为复管泡状腺，由被膜、间质和实质组成。一般来说，上皮细胞构成了乳腺实质的腺泡和导管系统。多数上皮是内衬于腺泡腔表面，具有分泌功能的腺泡上皮，除此之外还有构成导管系统的导管上皮以及包绕在导管和腺泡外表面的肌上皮。构成间质的主要是脂肪细胞，但是成纤维细胞、造血系统细胞、血管和神经也存在其中。

乳腺上皮细胞是研究乳腺生长发育、泌乳机制以及验证乳腺组织特异性表达载体有效性的体外模型。目前原代乳腺上皮细胞培养大都采用胶原酶消化法和组织块培养法。利用胶原酶消化乳腺组织，再经过密度梯度离心可以得到较纯净的上皮细胞，但此种方法操作复杂，往往因为消化和离心而损失大量细胞，对后期的传代培养和实验造成不利影响。组织块培养法操作过程简单，节约组织样品，而且避免了消化和离心对细胞造成的不良影响。但是细胞从组织块中长出所需的时间较长，成纤维细胞等结缔组织细胞最先长出，上皮细胞大量出现较为滞后。无论是采用胶原酶消化法还是组织块培养法，原代乳腺上皮细胞的培养均得到上皮细胞和成纤维细胞的混合物。

现在研究可知目前没有可用于研究的商品化的反刍动物乳腺上皮细胞系，当前用于研究的乳腺上皮细胞多是由科研人员自行从乳腺组织中分离，主要应用的分离方法是组织块培养法和酶消化法。乳腺组织中细胞类型众多，采用上述方法获得的乳腺上皮细胞都是多种类型细胞的混合体，必须进行纯化培养后才能用于后续实验，但是其分离和纯化效果都难以令人满意，因此需要更加有效的分离和纯化方法。

发明内容

本发明基于上述原因，提供了一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，该方法主要包括以下步骤：1）组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；2）分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞；3）纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞即可得到纯化的乳腺上皮细胞。本发明方法操作简便，通过常规的细胞培养操作即可得到充分纯化的乳腺上皮细胞。采用本发明获得的乳腺上皮细胞形态整齐、增殖旺盛，可应用于乳腺生长发育、泌乳机制以及验证乳腺组织特异性表达载体有效性的研究。

本发明的具体技术方案是：

一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，该方法主要包括以下步骤：

1）组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；

2）分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞；

3）纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞即可得到纯化的乳腺上皮细胞。

更为具体的方法是：

1）组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；发明人发现当选用纯种崂山奶山羊泌乳期30天的乳腺腺泡组织时，可以为后续工作取得更好的效果。

2）分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞，具体步骤为：

a.用含有200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素的PBS清洗上述获得的乳腺腺泡组织，并将其分割成0.5-1mm³的小组织块；

b.用高浓度血清培养基浸润a中所述小组织块，以间隔0.5cm接种于培养皿底，在37℃、5vt%浓度CO₂、饱和湿度的培养箱中静置培养4小时，上述高浓度血清培养基为含有50vt%FBS的DF12培养基；

其中所述的高浓度血清培养基为FBS和DF12以体积比1:1配制出的培养基；这也是本发明与现有技术的不同之一，现有技术中一般FBS和DF12是以体积比1:9的配比制备培养基，如下述步骤c中的培养液，但是在该步骤中发明人却采用了这种高浓度的血清培养基，实际上相当于传统方法中在培养皿底包被胶原的步骤，但是步骤没有包被胶原那么繁琐，降低了操作的难度，能够起到较好的效果，主要体现在1.有利于组织块的贴壁，2.有利于组织细胞的游出与生长两个方面；同时，发明人在实验了现有技术中FBS和DF12以体积比1:9的配比制备培养基之后，发现这一培养基难以满足组织贴壁的需要，故而进行了多次实验和调整后，最终确定了采用FBS和DF12以体积比1:1配制出的培养基；采用这种培养基浸润组织块后可以实现快速贴壁，且这种培养基仅作为浸润时使用，并不用于后续的培养，而由于采用了组织贴壁法，相比与现有的酶消化法获得的细胞而言，这种方法避免了长时间酶消化可能对细胞造成的损伤。