[发明专利]一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法

权利要求书

1.一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，该方法主要包括以下步骤：

1）组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；

2）分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞；

3）纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞即可得到纯化的乳腺上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞，具体步骤为：

a.用含有200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素的PBS清洗获得的乳腺腺泡组织，并将其分割成0.5-1mm³的小组织块；

b.用高浓度血清培养基浸润a中所述小组织块，以间隔0.5cm接种于培养皿底，在37℃、5vt%浓度CO₂、饱和湿度的培养箱中静置培养4小时;上述高浓度血清培养基为含有50vt%FBS的DF12培养基；

c.向上述培养皿中加入培养液，使其刚好覆盖培养皿底，置于37℃、5vt%浓度CO₂、饱和湿度的培养箱中静置培养，12小时后补加培养液至完全浸没组织块为止，2天后更换半量培养液，以后每2天更换半量培养液，总共培养至少8天后即得混合其它细胞生长的乳腺上皮细胞;

上述培养液为体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μg/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗。

3.根据权利要求1所述的山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞，得到纯化的乳腺上皮细胞，具体步骤如下：

a.差速消化法：向步骤（2）获得的混合其它细胞生长的乳腺上皮细胞的培养物中加入消化液消化细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，待成纤维细胞脱离底壁时，吸弃消化液去除成纤维细胞，利用残留的消化液继续消化1-2分钟，加入培养液终止消化，将剩余的细胞吹打成单细胞悬液；

其中所述消化液为等体积混合的不含钙镁离子的PBS和0.25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液，消化条件为室温25℃，成纤维细胞消化时间为1.5-2分钟；

所述的培养液为体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μg/L表皮生长因子和10万IU/L；

b.差速贴壁法：将上述的单细胞悬液移入新的培养皿中培养20分钟，待成纤维细胞贴壁后，转移培养液至另一个新的培养皿中继续培养，原培养皿添加新的培养液继续培养，如此转移3次，每次转移的时间间隔均为20分钟，12小时后更换培养液，以后每2天换液一次；

上述各培养皿培养3-4天后，选择其中纯化程度和生长密度最好的培养皿，重复步骤a和步骤b进行传代纯化，如此传至第4代即得到纯化的乳腺上皮细胞。

4.根据权利要求2所述的山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中b步骤中浸润时间控制在2-4min。