[发明专利]一种莴苣花粉离体萌发培养基及测定花粉活力的方法

权利要求书

1.一种莴苣花粉离体萌发液体培养基，以蒸馏水为溶剂，其特征在于：其包含的组分为ME₃，170－190g·L^-1的PEG4000和90－110g·L^-1的蔗糖，pH为5.8－6.0；

所述ME₃的组分为：硝酸钾950－1050mg·L^-1、氯化铵261.25－288.75mg·L^-1、四水硝酸钙1520－1680mg·L^-1、磷酸二氢钾80.75－89.25mg·L^-1、氯化钾166.25－183.75mg·L^-1、七水硫酸镁475－525mg·L^-1、碘化钾0.83mg·L^-1、硼酸100mg·L^-1、五水硫酸铜0.025mg·L^-1、二水钼酸钠0.25mg·L^-1、六水氯化钴0.025mg·L^-1、乙二胺四乙酸二钠7.45mg·L^-1、七水硫酸亚铁0.025、盐酸吡哆醇1.0mg·L^-1和盐酸硫胺1.0mg·L^-1；

一种莴苣花粉离体萌发液体培养基的制备方法，其步骤如下：

A、配置母液：大量元素、微量元素、铁盐，有机物，在制备母液的时候，按比例称取每种成分，使每种成分分别溶解于蒸馏水，然后混合，定容到1L，贮存于玻璃瓶中，置冰箱保存备用，其中配制铁盐母液时将FeSO₄·7H₂O 和Na₂EDTA分别置于450ml蒸馏水中，78-82℃条件下加热并搅拌溶解，将FeSO₄·7H₂O 和Na₂EDTA溶液混合，加蒸馏水到最终容积1L，贮存于棕色玻璃瓶中，置冰箱保存备用；

B、称取180g PEG4000和 100g蔗糖，分别置于1000mL：PEG4000和500 mL：蔗糖玻璃烧杯中，分别加入500ml和250ml蒸馏水使PEG和蔗糖溶解，将溶解后的蔗糖溶液混入PEG4000溶液中，混合均匀，按照大量元素、微量元素、铁盐、有机成分分别为50ml、5ml、5ml、5ml的顺序加入PEG和蔗糖混合液，然后用蒸馏水定容至最终体积1L,混合均匀；

C、最后用1mol·L^-1的NaOH或1mol·L^-1的HCl调整pH值至5.8－6.0，获得花粉离体液体培养基。

2.权利要求1所述的一种液体培养基离体培养莴苣花粉萌发测定花粉活力的方法，其步骤如下：

（1）采集花粉：

选取发育正常、无病虫害、生长健壮的植株，于莴苣盛花期选取当天开放的花序，连同花枝一起采取，移入盛有清水的保鲜袋，带回实验室内；

（2）花粉离体液体培养基的制备：

以蒸馏水为溶剂，所含组分为：硝酸钾950－1050mg·L^-1、氯化铵261.25－288.75mg·L^-1、四水硝酸钙1520－1680mg·L^-1、磷酸二氢钾80.75－89.25mg·L^-1、氯化钾166.25－183.75mg·L^-1、七水硫酸镁475－525mg·L^-1、碘化钾0.83mg·L^-1、硼酸100mg·L^-1、五水硫酸铜0.025mg·L^-1、二水钼酸钠0.25mg·L^-1、六水氯化钴0.025mg·L^-1、乙二胺四乙酸二钠7.45mg·L^-1、七水硫酸亚铁0.025mg·L^-1、盐酸吡哆醇1.0mg·L^-1和盐酸硫胺1.0mg·L^-1、聚乙二醇4000170－190g·L^-1、蔗糖90－110g·L^-1，混合均匀，调节pH值至5.8－6.0；

（3）花粉的撒布及培养：

将载有液体培养基的载玻片水平放置于实验台上，用镊子摘除头状花絮的花瓣，剥开聚药花蕊取出花药，夹住花药下方花丝，将花药在培养基表面滑动使花粉单层、均匀地散落分布在培养基表面上，在300－400μmol·m^-2·s^-1光强光照条件下、相对空气湿度90%、24－26℃恒温培养箱中恒温培养，花粉离体萌发培养28－32 min后部分花粉开始萌发，花粉萌发后花粉管长度超过花粉粒直径，花粉管开始生长；

（4）花粉活力的测定：

离体培养1-3h后，以花粉管长度大于花粉粒直径作为花粉萌发的标准，每次观察三个视野，每个视野观察花粉数不少于30粒，统计花粉萌发率，重复三次取平均值为花粉萌发率测定结果，花粉萌发率反应有生活力花粉所占比例。