[发明专利]大蒜种质资源RAPD遗传多样性分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选大蒜种质的方法，特别涉及一种利用RAPD方法筛选大蒜种质的方法。

背景技术

中亚地区是大蒜的原产地，该地区大蒜品种多样，是最重要的大蒜进化中心^[17,20,111]。新疆地处中亚，其地产大蒜与内地省市大蒜的蒜氨酸含量差异显著^[112]，新疆境内不同品种大蒜的蒜氨酸含量也有差异^[113]，但根据外观性状难以区别鉴定。近年来，新疆已有种植户从异地盲目引种，导致品种退化，蒜氨酸含量明显下降，但对这些品种也无法通过外观性状进行鉴定，对大蒜栽培和育种工作造成困难，也严重威胁新疆优质大蒜的品质。因此，对新疆地产大蒜进行分子鉴定，开展遗传多样性研究，了解大蒜间的亲缘关系，区别种质的优劣非常必要。

国外学者主要采用RAPD、AFLP及同工酶标记对西欧、美洲等地的大蒜进行种质资源遗传多样性分析^{[55,57，114]}。国内学者则主要采用RAPD和ISSR及同工酶标记对大洋洲、亚洲部分国家和我国部分内地省市的大蒜进行亲缘关系和遗传特性的分析和鉴定^[60-64]。针对新疆主要栽培区的大蒜种质资源尚未开展分子水平上的研究。

作为一种基于PCR的分子标记技术，RAPD是由美国科学家Williams于1990年研究提出的^[115]，具有简便、快速、多态性好等特点^[116]，是一种快速灵敏的分子标记，已广泛运用于多种植物的种内和种间遗传多样性研究和种性鉴定，并表现出了很强的多态性^[117-121]，也已应用于葱属品种遗传关系的分析^[122-124]及大蒜品种遗传多样性分析^{[57,60,62-64,114]}。RAPD技术对反应条件比较敏感，重复性较差，许多研究表明，采用优化的反应体系可获得稳定性高、重复性好的RAPD谱带^[125-127]，因此，需要筛选和确定该标记技术对于供试材料的最佳PCR反应条件和反应程序，建立具有高度重复性和稳定性的反应体系。

本实验采集新疆主要栽培区不同居群及部分内地传统种植省区的大蒜样品，采用RAPD分子标记技术进行大蒜种质资源遗传多样性研究；包括提取大蒜基因组DNA，探讨RAPD分子标记技术对于大蒜的适用性，建立和优化RAPD反应体系，获取并科学分析多态性RAPD谱带，构成遗传相似系数矩阵，进行遗传多样性的聚类分析；旨在阐明新疆大蒜与内地省区大蒜以及新疆主要栽培区不同品种大蒜之间的亲缘关系，为大蒜种质资源评价提供依据，为药用大蒜优质种质的筛选奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种利用RAPD方法分析大蒜的遗传多样性进而筛选大蒜种质的方法，所述方法步骤简便、试剂相对便宜、扩提取效果优，重复性好。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用RAPD方法分析大蒜的遗传多样性进而筛选大蒜种质的方法，包括以下具体步骤：

1、大蒜基因组DNA的提取

(1)用洁净剪刀剪取大蒜嫩苗(优选离尖端约2cm)，并用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸去材料表面的水分。

(2)称取幼嫩叶片约0.2g，置于经液氮冷冻的研钵中，小心加入液氮，充分研磨至粉末状。

(3)用经灭菌的不锈钢勺将粉末装入离心管，加65℃预热的质量浓度为2％CTAB分离缓冲液2.0ml，65℃水浴中放置30min，期间混匀3次。

(4)放冷后，加入等体积氯仿-异戊醇(氯仿：异戊醇的体积比为24：1)，小心颠倒离心管2～3次，混匀，10000r／min离心10min。

(5)转移上清到一个新管中，并加入氯仿600μl，小心颠倒离心管2～3次，混匀，10000r/min离心10min。

(6)转移上清到一个新管中，并加入2倍体积无水乙醇，置于-20℃冰浴20min，10000r／min离心10min，弃去上清。

(7)加入体积比为75％乙醇1ml清洗沉淀，10000r／min离心5min，离心，弃去上清，再次离心，吸除剩余乙醇，室温下将DNA自然干燥10min。

(8)加入50μl TE缓冲液，涡旋促进DNA溶解。

(9)置于-20℃贮存。

2、DNA浓度和纯度的检测