[发明专利]大蒜种质资源RAPD遗传多样性分析方法

权利要求书

1.一种大蒜种质资源RAPD遗传多样性分析方法，包括以下具体步骤：

1)、提取大蒜基因组DNA；

2)、检测DNA的浓度和纯度；

3)、RAPD随机引物的筛选：以大蒜品种DNA为模板，对随机引物进行PCR扩增，凝胶成像后，选择出有多态性条带的引物，然后以所有大蒜品种DNA为模板进行PCR扩增，凝胶成像后，继续筛选条带清晰、不少于3条清晰条带、重复性好的引物；

4)、PCR反应体系

PCR反应总体积25μl，其中含模板DNA20-80ng，引物5-15pmol，dNTP5-15μmol，Taq DNA聚合酶0.2-2U，10xPCR反应缓冲液1.5-3.5μl，以重蒸馏水补充至25μl；

5)、PCR扩增程序

退火温度为31.5-40.5℃，循环次数为35-45次；

6)、PCR扩增产物的电泳检测

在25μl PCR反应终产物中，取5μl样品，加溴酚蓝指示剂溶液1μl混合，在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电泳电场强度为5V／cm，凝胶成像系统下观察拍照；

7)、条带信息分析

以蒜氨酸含量高的为优质大蒜种质对照，或以蒜氨酸含量低的为非优质大蒜种质对照，将需要筛选的大蒜种质经DNA提取、RAPD扩增获得的电泳谱图中条带与上述对照做聚类比较，如能与优质大蒜种质聚为一类或距离较近，该种质可以判断为优质种质，随后可以采用高效液相色谱法测定该种质蒜氨酸含量进行验证。

2.如权利要求1所述的方法，其中，3)中所述随机引物如下表所示：

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述PCR反应体系是：PCR反应总体积25μl，其中含模板DNA50ng，引物10pmol，dNTP10μmo1，MgCl₂50μmol，Taq DNA聚合酶1.5U，10xPCR反应缓冲液2.5μl，以重蒸馏水补充至25μ1。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述退火温度为31.5℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、38.9℃、39.5℃、39.7℃或40.5℃。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述循环次数为35个循环、40个循环或45个循环。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述PCR扩增程序是：94℃预变性3min；94℃变性45s，36℃退火1min，72℃延伸1.5min，共40个循环；72℃最终延伸7min。