[发明专利]一种基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞膜色谱技术领域，涉及一种基于微载体的细胞固定相及其制备方法。

背景技术

细胞膜色谱法（CMC）是贺浪冲教授及其课题组于1996提出的一种生物亲和色谱法，适用于中药复杂体系中活性成分的筛选和分离，该方法是以硅胶为载体，将细胞膜与硅胶混合以后填充色谱柱，制备细胞膜色谱柱，结合高效液相色谱法筛选中药材中的活性成分，药物筛选的靶点为细胞膜上的受体，细胞膜色谱可以直接从中药提取的复杂成分中识别出可以与药物靶点作用的活性成分，是一种快速高效的筛选方法。然而，细胞膜色谱也存在一些缺陷，CMC法用的是自然生物膜(组织细胞)，膜受体的密度较小，柱效较低，色谱柱寿命通常比较短，其分离的重现性和精密度得不到保证，自然生物膜存在有多种活性蛋白，药物可能与多种受体或通道蛋白结合，尚不能完全模拟体内复杂环境以及机体内其他系统对药物发挥药效作用的影响。

微载体是指直径是60-250μm，能够适用于贴壁型细胞生长的微球，细胞培养最早使用离子交换凝胶作为载体，开始于19世纪60年代末期，轻微搅动即可悬浮在培养基中，这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖。载体处于悬浮状态时，这样既可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。微载体选择应以利于细胞贴壁生长，又无毒性为原则，然而离子交换凝胶作为载体存在许多缺点，如在一定程度上对细胞有毒性，对培养基的pH也有一定影响，因而近年来对载体进行了改良，目前使用的载体主要有三种类型，它们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Cytopore(Cytodex1、2、3)。由于微载体所带有的基团不同，就决定了它们之间的差异，I型载体是整个载体带正电荷，II型仅表面带有正电荷，Ⅲ型不带有电荷，其外表面被胶原层包裹，同样适于细胞附着和生长。Cytopore微载体的大孔结构促进细胞向微球内生长，小孔提供尽可能多的营养成分。这种特点可帮助需要高循环率和高营养的细胞生长。微载体比离子交换凝胶有明显的优点：①大小和表面性质更适宜细胞生长；②具有一定的透明度，便于显微镜观察；③无毒性，适于各类细胞附着生长。

微载体培养技术是一种新兴的大规模细胞培养技术，具有比表面积大，兼有悬浮培养和贴壁培养等优点，放大容易，在微球表面培养细胞可以在较短时间内得到大量的细胞，且细胞传代只需要添加新的微载体，基本上可避免细胞在胰酶消化过程中受到的损伤，因此微载体培养细胞技术是非常方便和有意义的。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于微载体细胞的细胞固定相及其制备方法，该固定相具有单一细胞的特性，且保持了细胞原有的基本特性，药物的受体也保持基本的空间结构。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于微载体细胞的细胞固定相，其特征在于，包括色谱柱，色谱柱中填充有作为色谱固定相的微载体细胞；所述的微载体细胞是将贴壁生长于微载体表面的细胞，通过交联链固定于微载体表面而得到的。

所述的微载体为葡聚糖凝胶制备的微载体Cytodex，所述的细胞为细胞膜上表达有能够与药物结合的受体的细胞，所述的交联链是利用多聚甲醛与细胞中的蛋白质末端基团之间形成交联链，而固定于微载体表面。

所述微载体细胞通过湿法装入色谱柱中。

一种基于微载体细胞的细胞固定相的制备方法，包括以下操作：

1）将微载体置于硅化的培养容器中，活化后灭菌，然后加入DMEM培养基过夜，临用前吸弃原培养基，换37℃温热的DMEM培养基，制成微载体悬液；

2）将微载体悬液置入培养容器中，接种细胞悬液，然后加入DMEM培养液；将培养容器直立于CO₂培养箱中培养2～3h，去除旋转摇动1～2min；之后每1～2小时摇一次，每12～24h更换一次培养基；

3）待细胞贴壁生长于微载体后，取处于对数期贴壁生长于微载体上的细胞悬液，加入质量浓度4%的多聚甲醛溶液，室温固定15～30min后，将细胞通过交联链固定于微载体表明，得到微载体细胞；

4）将微载体细胞作为色谱固定相，湿法装入色谱柱中，得到用于药物筛选的细胞色谱柱。

所述的微载体为葡聚糖凝胶制备的微载体Cytodex，直径为100～250μm，其活化为：将微载体置于硅化的容器中，用PH=7.4的PBS冲液洗涤后，更换新鲜的PBS浸泡过夜；