[发明专利]牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及人畜共患传染病病原体的检测技术领域，具体涉及一种牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

布鲁氏菌表面蛋白31（Brucella cellsurface protein31ku，BCSP31）基因于1988年被克隆测序和体外表达，它编码了大小为31ku具有免疫原性的可溶性细胞表面蛋白质，除了绵羊附睾布鲁氏菌外，在其他6种布鲁氏菌中均可检测到BCSP31蛋白的表达。布鲁氏菌BCSP31基因在8株不同属来源的布鲁氏菌菌株中同源性达99.3%，是布鲁氏菌种属特异性基因，具有高度保守性。

目前，已有学者利用真核表达的方法表达了BCSP31蛋白，并利用其真核表达产物免疫小鼠，研究其在小鼠体内的抗布鲁氏菌感染的能力；也有学者利用原核表达载体pGEX4p-1表达了BCSP31蛋白，并研制了BCSP31蛋白的单克隆抗体。

目前，布鲁氏菌PCR快速分子生物学诊断方法的建立通常是基于布鲁氏菌BCSP31基因的克隆，获得特异性的目的片段进行诊断布鲁氏菌病。然而，目前利用布鲁氏菌BCSP31蛋白作为抗原建立布鲁氏菌病血清学诊断方法还没有报道。

发明内容

为了解决现有采用其他抗原检测牛羊布鲁氏菌病存在的敏感性低、特异性不高的问题，本发明提供一种牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法，本发明利用BCSP31蛋白作为抗原建立了牛羊布鲁氏菌病间接ELISA抗体检测方法，并研制了相应的检测试剂盒。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，该试剂盒是以SUMO为表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白作为抗原包被酶标板，分别加入待检血清和二抗，并配以洗涤缓冲液、封闭液、TMB底物溶液和终止液组装而成，所述二抗为兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG。

所述抗原的制备方法如下：

（1）布鲁氏菌BCSP31蛋白的表达、纯化及检测

①根据GenBank公布的牛种布鲁氏菌BCSP31蛋白序列设计引物：

上游引物P₁：5’-TGACCTGCTAGTAGGTATGAAATTCGGAAGCA-3’，

下游引物P₂：5’-TGTCTAGATTATTTCAGCACGCCCGCT-3’；

②分别以羊种布鲁氏菌标准菌株16M、羊种布鲁氏菌疫苗株M5及牛种布鲁氏菌标准菌株544A的基因组DNA为模板，PCR扩增BCSP31基因片段；

③将PCR产物纯化后连于Blunt载体上进行克隆转化，获得BCSP31克隆质粒；

④选择SUMO载体为表达载体，用BfuAI和XbaI分别酶切测序比对正确的BCSP31克隆质粒和SUMO空载体质粒；

⑤回收酶切产物，用T4连接酶连接，16℃过夜，构建SUMO-BCSP31重组表达质粒；

⑥将获得的SUMO-BCSP31重组表达质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，获得阳性克隆质粒；

⑦将阳性克隆质粒转入大肠杆菌BL21进行诱导表达，终浓度为1mM的IPTG诱导6h后，超声裂解菌体，离心收取上清和沉淀，所表达的BCSP31蛋白在细胞上清中；

⑧将上述细胞上清经镍柱纯化，再用BCA法测定纯化的BCSP31蛋白的浓度，在53kDa处得到单一目的条带。

⑨将获得的重组的布鲁氏菌BCSP31蛋白冻干保存。

所述洗涤缓冲液为PBST溶液，其配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液。

所述封闭液的配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2%BSA，摇匀，得到封闭液。

所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，其配制方法为：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入98%的浓硫酸21.7ml，得到终止液。

制备牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的方法，该方法的条件和步骤如下：

（1）抗原包被酶标板