[发明专利]牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于，

该试剂盒是以SUMO为表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白作为抗原包被酶标板，分别加入待检血清和二抗，并配以洗涤缓冲液、封闭液、TMB底物溶液和终止液组装而成，所述二抗为兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG。

2.根据权利要求1所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗原的制备方法如下：

（1）布鲁氏菌BCSP31蛋白的表达、纯化及检测

①根据GenBank公布的牛种布鲁氏菌BCSP31蛋白序列设计引物：

上游引物P₁：5’-TGACCTGCTAGTAGGTATGAAATTCGGAAGCA-3’，

下游引物P₂：5’-TGTCTAGATTATTTCAGCACGCCCGCT-3’；

②分别以羊种布鲁氏菌标准菌株16M、羊种布鲁氏菌疫苗株M5及牛种布鲁氏菌标准菌株544A的基因组DNA为模板，PCR扩增BCSP31基因片段；

③将PCR产物纯化后连于Blunt载体上进行克隆转化，获得BCSP31克隆质粒；

④选择SUMO载体为表达载体，用BfuAI和XbaI分别酶切测序比对正确的BCSP31克隆质粒和SUMO空载体质粒；

⑤回收酶切产物，用T4连接酶连接，16℃过夜，构建SUMO-BCSP31重组表达质粒；

⑥将获得的SUMO-BCSP31重组表达质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，获得阳性克隆质粒；

⑦将阳性克隆质粒转入大肠杆菌BL21进行诱导表达，终浓度为1mM的IPTG诱导6h后，超声裂解菌体，离心收取上清和沉淀，所表达的BCSP31蛋白在细胞上清中；

⑧将上述细胞上清经镍柱纯化，再用BCA法测定纯化的BCSP31蛋白的浓度，在53kDa处得到单一目的条带。

⑨将获得的重组的布鲁氏菌BCSP31蛋白冻干保存。

3.根据权利要求1所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为PBST溶液，其配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液。

4.根据权利要求1所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液的配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2%BSA，摇匀，得到封闭液。

5.根据权利要求1所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，其配制方法为：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入98%的浓硫酸21.7ml，得到终止液。