[发明专利]一种无菌松材线虫的制备方法

说明书

技术领域

本发明是涉及无菌松材线虫的制备方法的改进。

背景技术

松材线虫病是松材线虫引起的松树的一种毁灭性病害，又称松树萎蔫病。松材线虫病具有导致树木死亡速度快、传播蔓延迅速、防治难度大等特点，松树一旦感染松材线虫，最快的40天左右即可枯死，幼苗感病后20多天即可枯死，3-5年便可造成大面积毁林。我国于1982年在南京中山陵首次发现松材线虫病，此后，该病在我国境内迅速扩散蔓延，危害日趋严重，现已在江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、陕西、香港及台湾等地区发生，发生面积达8.7万公顷，累计致死松树3,500多万株,因松材线虫病造成的直接经济损失已达25亿元，间接损失达250亿，使我国的松木资源、自然景观和生态环境遭受严重影响。

发明内容

本发明就是针对上述问题，提供一种灵敏快速的无菌松材线虫的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，本发明包括以下步骤。

1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。

2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中备用。

作为一种优选方案，本发明还包括以下步骤。

将消毒松材线虫虫卵培养后获得的松材线虫，在无菌条件下用无菌水从灰葡萄孢斜面上收集下来，在无菌条件下研磨成线虫匀浆，取一部分匀浆均匀涂在NA平板上，放置到28℃恒温培养箱中培养三天，以检测虫卵消毒效果。

作为另一种优选方案，本发明还包括以下步骤。

将消毒后松材线虫匀浆用做PCR模板，未做消毒处理的线虫匀浆作为对照，同时以无菌水和大肠杆菌菌液分别作为阴性对照和阳性对照，以细菌通用引物进行PCR扩增，检测松材线虫消毒效果。

本发明有益效果：本发明采用PCR方法检测消毒效果可弥补传统培养方法的缺点，结合对线虫和虫卵进行多步消毒的方法，建立了获得无菌线虫的技术。与传统培养检测的方法相比，PCR方法检测细菌污染更灵敏更快速，可检测到1克样品中存在的0.4CFU（colonyformingunits）的污染。 

具体实施方式

本发明采用如下技术方案，本发明包括以下步骤。

1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用。

2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中备用。

本发明还包括以下步骤。

将消毒松材线虫虫卵培养后获得的松材线虫，在无菌条件下用无菌水从灰葡萄孢斜面上收集下来，在无菌条件下研磨成线虫匀浆，取一部分匀浆均匀涂在NA平板上，放置到28℃恒温培养箱中培养三天，以检测虫卵消毒效果。

本发明还包括以下步骤。