[发明专利]一种无菌松材线虫的制备方法

权利要求书

1.一种无菌松材线虫的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将葡萄孢接种于PDA培养基上，25℃恒温培养箱中培养7天，待气生菌丝基本长满培养皿时接种松材线虫，每皿接种约200头线虫；将接种后的培养皿置25℃恒温培养箱中培养10-14天，待菌丝基本被线虫消耗完后，置于4℃储存备用；

2）松材线虫的分离采用贝尔曼漏斗分离法；其装置是将直径10-15cm的玻璃漏斗架在铁架上，下面接一段约10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一个1.5ml离心管，橡皮管上装一个弹簧夹；在漏斗内放一个用细铜纱制成的漏斗状网筛，将面巾纸或滤纸裁剪好后放置到漏斗状网筛上，用蒸馏水浸湿滤纸，然后将待分离的培养基材料切碎放置到滤纸上；加水淹没待分离培养基材料，静止分离24h；由于趋水性和自身的重量，线虫就离开培养基材料，沉降到漏斗底部的离心管中；关闭弹簧夹，取下离心管，将管中收集到的线虫转移至另一离心管中备用。

2.根据权利要求1所述一种无菌松材线虫的制备方法，其特征在于还包括以下步骤：

将消毒松材线虫虫卵培养后获得的松材线虫，在无菌条件下用无菌水从灰葡萄孢斜面上收集下来，在无菌条件下研磨成线虫匀浆，取一部分匀浆均匀涂在NA平板上，放置到28℃恒温培养箱中培养三天，以检测虫卵消毒效果。

3.根据权利要求2所述一种无菌松材线虫的制备方法，其特征在于还包括以下步骤：

将消毒后松材线虫匀浆用做PCR模板，未做消毒处理的线虫匀浆作为对照，同时以无菌水和大肠杆菌菌液分别作为阴性对照和阳性对照，以细菌通用引物进行PCR扩增，检测松材线虫消毒效果。