[发明专利]一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。

（二）发明背景

B型产气荚膜梭菌可引起羔羊痢疾、绵羊、山羊、驹及犊牛的肠毒血症或坏死性肠炎，主要致病毒素为α、β、ε毒素。由β-毒素引起的坏死性肠炎，一般认为是由于食物中的胰蛋白酶阻止了肠道中该毒素的分解，从而导致该病的发生。此外，该毒素可能还是一种神经毒素。而B型ε-毒素的分泌量少，它则可促使动物的主动脉和其它动脉收缩而导致血压升高；此外，还具有与血脑屏障内血管上皮受体结合的能力，从而引起血管通透性增高，最终导致致死性水肿，但ε-毒素不耐热（Mcdonel,1986）。

多年来，我国生产中使用的是灭活菌苗，早在1989年，陈锡全等已经开展了“兔病毒性出血症和A型魏氏梭菌联苗”的研究并且取得成功；佟承刚等（1991）研制兔的魏氏梭菌单苗，对实验动物可以产生82.01%的保护率；鲁承（1997）等对兔瘟病毒和A型魏氏梭菌二联苗进行了研究；杨瑛（1997）对A型魏氏梭菌氢氧化铝灭活苗进行研究，疫苗0.6ml、2ml、4ml可以保护小鼠、兔和猪抵抗标准A型1MLD毒素的攻击；姚湘燕等（1998）采用三个不同来源的牛源魏氏梭菌分离株研制牛魏氏梭菌浓缩AL(OH)₃灭活苗；王克领（1998）等对兔出血病、魏氏梭菌病、巴氏杆菌病三联苗进行了研究；谭诗文等（2000）进行了羔羊痢疾、羊肠毒血症、大肠杆菌病、羊猝狙四联油佐剂灭活苗的研制。这些菌苗对该病的预防有一定的效果，同时也存在一些不足：最关键地是疫苗中的有效成分主要为菌体抗原，诱导机体产生的抗体只能够中和菌体抗原，却难以中和毒素抗原，与家畜“猝死症”致病机理不全相符。因此，灭活菌苗的有效性还存在一些质疑。

柴同杰（2001）对家畜“猝死症”致病机理的研究发现：在某种应激状态下，动物肠道中微生态平衡破坏，使魏氏梭菌呈‘爆炸性’的繁殖，瞬间产生大量的外毒素，肠粘膜通透性的升高使得毒素或细菌+毒素进入血液循环引起毒血症（有时伴有菌血症），从而导致重要器官的衰竭，造成动物死亡；由此，进一步提出，“魏氏梭菌感染致病以及动物快速死亡的主要原因是肠源性毒血症，预防的关键在于针对毒素引起的毒血症，疫苗的抗原成分应是相应的类毒素”的学说。

B型产气荚膜梭菌引发的羔羊痢疾等疾病发病急，死亡快，有时症状不太明显并且根本来不及治疗。要从根本上控制本病的传播，减少或避免经济损失，必须采取切实有效的预防措施。产气荚膜梭菌形成的主要外毒素的化学成分为蛋白质，具有较好的免疫原性。因此，根据产气荚膜梭菌的发病机理，制备产气荚膜梭菌外毒素，将其灭活后做成类毒素疫苗，用于畜禽预防。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明发明提供了一种效价全、免疫力强、针对性好、无毒副作用的羔羊痢疾B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，用于动物的B型产气荚膜梭菌病特别是羔羊痢疾的预防，控制羔羊痢疾等B型产气荚膜梭菌病的流行。

羔羊痢疾等B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1B型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上在厌氧环境（气体的组成为85％氮气9％氢气6％二氧化碳）下37℃46h复苏。

2B型产气荚膜梭菌接种在硫乙醇酸盐流体培养基中，在厌氧环境（气体的组成为85％氮气9％氢气6％二氧化碳）下38℃14h培养增菌。

3将8ml上述培养物加入到产毒培养基（每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸）中，在厌氧环境下振荡培养，221摆/min，38℃培养5h，然后在4℃3800g离心15min，再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌,即得外毒素溶液。

4在外毒素溶液中加入外毒素溶液体积比为0.3%的甲醛，充分振荡混匀，置37℃48h灭活，间隔5-6h振摇一次，得到灭活好的类毒素溶液。

5在类毒素溶液中按1:1体积比加入灭菌的白油佐剂乳化，每100毫升乳化液中加入0.01克硫柳汞制得B型产气荚膜梭菌类毒素疫苗；

所述白油佐剂构成：9份白油和一份Span-80混合后加入白油和Span-80混合液体积比2%的Tween-20和质量比1%的硬脂酸铝；

所述的血平板培养基成分为：100毫升蒸馏水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5%体积比绵羊血；

所述的产毒培养基成分为：每100mlPBS缓冲液溶解2g胰蛋白胨、1g糊精、2g酵母浸膏和1.2gL-精氨酸；