[发明专利]黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术及应用

说明书

技术领域

本发明为一种黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术及应用，专用于检测黄瓜细菌性角斑病菌，属于农作物病害诊断与防治技术领域。

背景技术

黄瓜细菌性角斑病由丁香假单胞流泪致病变种（Pseudomonas syringae pv. lachrymans，Psl）引起，该病原菌属于丁香假单胞50个致病变种之一，是引起黄瓜（Cucumis sativus）的主要细菌性病害之一。该病原引起细菌性角斑病（Angular leaf spot），在世界上广泛发生，我国主要分布在华北、东北及华中地区，保护地及露地生产中均有发生。感病植物的主要症状：叶脉呈水浸状小斑点，病斑褪绿，进一步扩展逐渐发展成为近圆形或不规则病斑，病果会出现水浸状病斑。黄瓜细菌性角斑病发病时间短，在适宜的发病条件下7-10d可发病，除顶端嫩叶外，可使黄瓜整株叶片枯死，影响结瓜产量，一般减产可达 30%-50%，造成严重的经济损失。

传统的病原细菌检测采用培养基分离纯化与致病性鉴定的方法，随后血清学技术的应用使得病原细菌的快速检测成为可能。Rassmusen和Prosen于1991年首次采用PCR方法检测植物病原菌及感染种子，推动基于PCR方法的植物病原菌检测技术快速发展。20世纪90年代中期发展起来的实时荧光定量PCR技术可以对靶标核酸进行精确定量检测，突破了传统PCR技术只能对目标核酸进行定性检测的局限。实时荧光定量PCR技术的原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和Ct值对未知模板进行定量分析的方法。常规PCR 中，扩增产物（扩增子）是通过终点法来分析检测，即PCR 反应结束后，DNA 通过琼脂糖凝胶电泳后进行成像分析。相对常规PCR 而言，应用实时荧光定量PCR 方法检测植物病原菌的主要优点是有实时性强，灵敏度高，特异性强，反应过程封闭，操作简易，处理量高等。

对黄瓜细菌性角斑病原菌的快速检测最早采用的方法是免疫学方法，特别是ELISA。Fogliano等建立基于ELISA的检测方法可以定量到0.1mg/g植物组织的角斑病原菌。而由于丁香假单胞种下致病变种多，难以获得特异性好的抗体，容易出现假阳性结果。基于PCR的分子生物学检测方法不受植物病症的限制，具有快速检测的特点。目前，通过ITS等序列的常规PCR方法可特异性检测角斑病原菌，但由于常规PCR本身存在的局限性，使得该方法的灵敏度和特异性受到局限，且常规PCR为半定量，不能定量检测受检植株或种子上的病原菌。由于黄瓜细菌性角斑病原菌为种传，少量甚至微量的病原菌在合适的气候条件下能够很快地传播，导致严重的病害流行，故高灵敏性和高特异性的实时荧光定量PCR检测黄瓜细菌性角斑病原菌的方法和对带菌种子的检测技术亟需建立。

发明内容

 本发明的目的在于提供角斑病菌的荧光定量PCR快速检测的方法，克服角斑病菌传统检测方法和半定量PCR检测方法的不足。

本发明的另一个目的在于提供一种荧光定量PCR试剂盒在黄瓜细菌性角斑病流行动态检测和种子带菌的早期检测等应用。

该检测技术，在植物病害诊断与防治领域适合推广。

本发明的技术具体包括以下步骤：

1、采用改良CTAB法提取病原菌总DNA，模拟带菌种子采用0.1%吐温20直接洗脱表面病原菌，得到相应的DNA样本；