[发明专利]黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术及应用

权利要求书

1.一种黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术，其特征在于包括以下步骤：

1）采用改良CTAB法提取病原菌总DNA，模拟种子带菌采用0.1%吐温20直接洗脱表面病原菌，得到相应的DNA样本；

2）特异性引物设计，通过分析丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）不同致病变种的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gap1）基因序列，采用CLUSTAL方法进行序列比较，对黄瓜细菌性角斑病原菌设计了其特异性PCR引物对Pslgap1-F/Pslgap1-R，所述的引物对为：正义引物Pslgap1-F序列为：5^，- TCGGCGACGCAATCAAT -3^，，反义引物Pslgap1-R 序列为：5^，- GGTGGTTTCACGCTTCAGG -3^，；

3）实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量反应体系为25μl，其中浓度为10μmol/L正义引物Pslgap1-F和反义引物Pslgap1-R各0.25μl、荧光染料SYBR Premix Ex Taq（内含TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg²⁺，SYBR GreenⅠ和 dNTP Mixture）12.5μl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液0.5μl，ddH₂O补齐至25μl；

4）PCR反应程序为：PCR采用两步法，94℃ 30s，然后94℃ 5s、62℃ 30s为1个循环，共35个循环，PCR完成后，按0.1℃/s升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；

5）插入gap1片段序列的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度（2.6ng-2.6fg DNA μl^-1），按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；

6）取步骤1）中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH₂O，阳性对照采用角斑病菌菌株基因组DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值（Ct）与标准曲线对照，得到DNA样本中的gap1基因片段拷贝数，进而得到原来样本中角斑病菌的浓度。

2.权利要求1所述的一种检测黄瓜细菌性角斑病菌荧光定量PCR检测技术，该技术可以转化成商品化的检测试剂盒，试剂盒包括：正义引物Pslgap1-F、反义引物Pslgap1-R、荧光染料SYBR Premix Ex Taq 内含TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg²⁺ ，SYBR GreenⅠ和 dNTP Mixture，以及由插入gap1片段序列的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取的质粒DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释。

3.权利要求1所述的对黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术可以应用于对农田环境中黄瓜植株上细菌性角斑病菌的动态监测，并可以应用于种子带菌及带菌量的检测。